采用多转染的细胞状态识别电路的快速开发

Summary

复杂的基因回路在设计、测试和优化方面非常耗时。为了促进这一过程，哺乳动物细胞的转染方式允许在单个孔中测试电路组件的多个化学计量。该方案概述了实验计划、转染和数据分析的步骤。

Abstract

哺乳动物遗传回路已经显示出感知和治疗各种疾病状态的潜力，但电路组件水平的优化仍然具有挑战性和劳动密集型。为了加速这一过程，我们的实验室开发了多转染，这是传统哺乳动物转染的高通量扩展。在多转染中，转染群体中的每个细胞基本上执行不同的实验，测试不同DNA拷贝数下的电路行为，并允许用户在单罐反应中分析大量化学计量。到目前为止，已经证明了优化单孔细胞中三组分电路比例的多转染;原则上，相同的方法可用于开发更大的电路。多转染结果可以轻松用于找到瞬时回路中DNA与共转染的最佳比例，或为产生稳定细胞系的电路组分选择表达水平。

在这里，我们演示了如何使用多转染来优化三组分电路。该方案从实验设计原则开始，并解释了多转染如何在传统共转染方法的基础上进行构建。接下来，进行细胞的多转染，几天后进行流式细胞术。最后，通过检查对应于具有特定成分比例的细胞亚群的单细胞流式细胞术数据切片来分析数据。在实验室中，多转染已被用于优化细胞分类器、反馈和前馈控制器、双稳基序等。这种简单但强大的方法加快了哺乳动物细胞中复杂遗传回路的设计周期。

Introduction

哺乳动物合成生物学领域发展迅速，从在培养细胞系中开发简单的感知和反应部分到优化复杂的基因网络，以应对诊断和治疗方面的现实^挑战1。这些精密电路能够检测从microRNA谱到细胞因子再到小分子药物的生物输入，并实现逻辑处理电路，包括晶体管、带通滤波器、拨动开关和振荡器。他们还在癌症，关节炎，糖尿病等疾病的动物模型中显示出有希望的结果1，²，³，^4，5。然而，随着电路复杂性的增加，优化其每个组件的电平变得越来越具有挑战性。

一种特别有用的遗传回路类型是细胞分类器，它可以被编程为感知和响应细胞状态。在特定细胞状态下选择性生产蛋白质或RNA输出是指导和编程细胞和类器官分化，识别和破坏患病细胞和/或不良细胞类型以及调节治疗细胞功能的有力工具¹，²，³，^4，5.然而，在哺乳动物细胞中创建能够准确分类来自多个细胞RNA和/或蛋白质物种的细胞状态的回路一直极具挑战性。

开发细胞分类回路最耗时的步骤之一是优化环内单个组分基因（如传感器和处理因子）的相对表达水平。为了加快电路优化并允许构建更复杂的电路，最近的工作使用细胞分类器电路及其组件的数学建模来预测最佳组成和拓扑6^，7。虽然到目前为止这已经显示出强大的结果，但数学分析受到需要系统表征电路中组件基因的输入输出行为的限制，这非常耗时。此外，在复杂的遗传回路中可能会出现无数与上下文相关的问题，导致完整回路的行为违背基于单个部分特征的预测8^，9。

为了更快地开发和测试复杂的哺乳动物电路，如细胞状态分类器，我们的实验室开发了一种称为多转染¹⁰的技术，这是质粒共转染方案的演变。在共转染中，将多个质粒DNA物种与带正电荷的脂质或聚合物试剂络合在一起，然后以相关方式递送到细胞（图1A）。在多转染中，质粒与试剂单独复合，使得每个转染复合物的DNA以去相关方式递送到细胞（图1B）。使用这种方法，转染群体中的细胞暴露于携带不同电路组件的两个或多个DNA有效载荷的多种比例组合中。

为了测量输送到每个细胞的电路元件的比例，多转染中的每个转染复合物都包含一个组成型表达的荧光报告基因，该荧光报告基因可作为细胞摄取复合物的代表。不含哺乳动物细胞内任何活性元素的填充DNA用于调节单个转染复合物中递送到细胞的荧光报告基因和电路元件的相对量，并在讨论中更详细地讨论。Weiss实验室中使用的填充DNA的一个例子是包含终止子序列的质粒，但没有启动子，编码序列等。然后可以比较具有不同电路组件比例的细胞，以找到基因回路功能的最佳比例。这反过来又为选择启动子和其他电路元件提供了有用的预测，以便在将电路组分组合到单个载体中进行遗传整合（例如，慢病毒、转座子或着陆垫）时达到最佳基因表达水平。因此，多转染不是根据 直觉或通过耗时 的试错过程来选择电路组件之间的比率，而是在单罐反应中评估遗传部分之间的各种化学计量。

在我们的实验室中，多转染已经优化了许多遗传回路，包括细胞分类器、反馈和前馈控制器以及双稳态基序。这种简单但强大的方法大大加快了哺乳动物细胞中复杂遗传回路的设计周期。此后，多转染已被用于表征多个遗传电路，以高分辨率¹⁰揭示其多维输入输出传递函数，优化细胞状态分类¹¹的替代电路拓扑，并加速各种已发表的^12，13 和正在进行的项目。

在这里，我们描述并使用多转染快速优化遗传电路的工作流程（图2）。该实验方案展示了如何生成高质量的多转染数据，并避免多转染方案和数据分析中的几个常见错误（图3）。然后演示如何使用多转染来表征简单的电路元件，并在此过程中将多转染结果与共转染进行基准比较（图4）。最后，多转染结果表明癌症分类器电路的优化（图5）。

Protocol

注意：表 1 和 表2 是该协议的重要参考。表 1 显示了反应的试剂缩放， 表2 显示了方案中描述的示例多转染（上半部分）和可能的后续实验（下半部分）的DNA比率算术。 1. 制备转染用细胞 在开始方案之前，确保人胚胎肾（HEK293）细胞的培养为60%-80%汇合。为此，2天前在100mm x 15mm组织培养培养皿中接种1 x 10…

Representative Results

在 图1中，我们比较了共转染与多转染。在共转染中，所有质粒都在同一转染混合物中递送，导致任何单个细胞接收的每个质粒的量之间存在高度相关性（图1A）。虽然递送到每个细胞的总质粒数量差异很大，但整个群体中单个细胞中两种报告蛋白的荧光密切相关，表明两种质粒以相当恒定的比例共同递送。转染的细胞可能摄取很少或许多复合物，但由…

Discussion

计算机辅助设计 （CAD）、试验板和 3D 打印等快速原型制作方法彻底改变了机械、电气和土木工程学科。快速搜索针对给定挑战的许多可能解决方案的能力极大地加快了该领域的进展。我们相信多转染是生物工程的类似技术，能够快速制作基因回路的原型。此外，其他快速原型技术需要对多种可能的解决方案进行手动顺序迭代，而多转染能够同时探索多种解决方案。多转染可以在单个孔中测试大?…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI