Schnelle Entwicklung von Schaltkreisen zur Identifizierung von Zellzuständen mit Poly-Transfektion

Summary

Komplexe genetische Schaltkreise sind zeitaufwändig zu entwerfen, zu testen und zu optimieren. Um diesen Prozess zu erleichtern, werden Säugetierzellen so transfiziert, dass mehrere Stöchiometrien von Schaltungskomponenten in einem einzigen Well getestet werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die experimentelle Planung, Transfektion und Datenanalyse.

Abstract

Genetische Schaltkreise von Säugetieren haben gezeigt, dass sie das Potenzial haben, eine Vielzahl von Krankheitszuständen zu erkennen und zu behandeln, aber die Optimierung der Ebenen von Schaltkreiskomponenten bleibt herausfordernd und arbeitsintensiv. Um diesen Prozess zu beschleunigen, hat unser Labor die Poly-Transfektion entwickelt, eine Hochdurchsatz-Erweiterung der traditionellen Transfektion von Säugetieren. Bei der Polytransfektion führt jede Zelle in der transfizierten Population im Wesentlichen ein anderes Experiment durch, bei dem das Verhalten des Schaltkreises bei unterschiedlichen DNA-Kopienzahlen getestet wird und die Benutzer eine große Anzahl von Stöchiometrien in einer Eintopfreaktion analysieren können. Bisher wurden Poly-Transfektionen demonstriert, die das Verhältnis von Drei-Komponenten-Schaltkreisen in einem einzigen Zelltopf optimieren. Prinzipiell kann die gleiche Methode für die Entwicklung noch größerer Schaltungen verwendet werden. Die Ergebnisse der Polytransfektion können leicht angewendet werden, um optimale Verhältnisse von DNA zu Co-Transfektion für transiente Schaltkreise zu finden oder um Expressionsniveaus für Schaltkreiskomponenten für die Erzeugung stabiler Zelllinien zu wählen.

Hier demonstrieren wir den Einsatz von Poly-Transfektion zur Optimierung einer Drei-Komponenten-Schaltung. Das Protokoll beginnt mit experimentellen Designprinzipien und erklärt, wie die Poly-Transfektion auf traditionellen Co-Transfektionsmethoden aufbaut. Als nächstes wird die Polytransfektion der Zellen durchgeführt und einige Tage später eine Durchflusszytometrie durchgeführt. Schließlich werden die Daten analysiert, indem Schichten der Einzelzell-Durchflusszytometriedaten untersucht werden, die Teilmengen von Zellen mit bestimmten Komponentenverhältnissen entsprechen. Im Labor wurde die Polytransfektion zur Optimierung von Zellklassifikatoren, Rückkopplungs- und Feedforward-Controllern, bistabilen Motiven und vielem mehr eingesetzt. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt Designzyklen für komplexe genetische Schaltkreise in Säugetierzellen.

Introduction

Das Gebiet der synthetischen Biologie von Säugetieren hat sich rasant weiterentwickelt, von der Entwicklung einfacher Sense-and-Response-Teile in kultivierten Zelllinien bis hin zur Optimierung komplexer Netzwerke von Genen, um reale Herausforderungen in der Diagnostik und Therapie anzugehen¹. Diese ausgeklügelten Schaltkreise sind in der Lage, biologische Eingaben von microRNA-Profilen über Zytokine bis hin zu niedermolekularen Medikamenten zu erfassen und logische Verarbeitungsschaltkreise wie Transistoren, Bandpassfilter, Kippschalter und Oszillatoren zu implementieren. Sie haben auch vielversprechende Ergebnisse in Tiermodellen für Krankheiten wie Krebs, Arthritis, Diabetes und viele mehr gezeigt 1,2,3,4,5. Mit zunehmender Komplexität einer Schaltung wird es jedoch immer schwieriger, die Pegel der einzelnen Komponenten zu optimieren.

Eine besonders nützliche Art von genetischem Schaltkreis ist ein Zellklassifikator, der so programmiert werden kann, dass er zelluläre Zustände erkennt und darauf reagiert. Die selektive Produktion von Protein- oder RNA-Outputs in bestimmten zellulären Zuständen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Differenzierung von Zellen und Organoiden zu steuern und zu programmieren, kranke Zellen und/oder unerwünschte Zelltypen zu identifizieren und zu zerstören und die Funktion therapeutischer Zellen zu regulieren 1,2,3,4,5 . Die Schaffung von Schaltkreisen in Säugetierzellen, die Zellzustände aus mehreren zellulären RNA- und/oder Proteinspezies genau klassifizieren können, war jedoch eine große Herausforderung.

Einer der zeitaufwändigsten Schritte bei der Entwicklung eines Zellklassifizierungsschaltkreises besteht darin, die relativen Expressionsniveaus einzelner Komponentengene, wie z. B. Sensoren und Verarbeitungsfaktoren, innerhalb des Schaltkreises zu optimieren. Um die Schaltungsoptimierung zu beschleunigen und den Aufbau anspruchsvollerer Schaltkreise zu ermöglichen, wurde in neueren Arbeiten die mathematische Modellierung von Zellklassifikatorschaltungen und deren Komponenten verwendet, um optimale Zusammensetzungen und Topologien vorherzusagen ^6,7. Während dies bisher starke Ergebnisse gezeigt hat, ist die mathematische Analyse durch die Notwendigkeit begrenzt, das Input-Output-Verhalten von Komponentengenen in der Schaltung systematisch zu charakterisieren, was zeitaufwändig ist. Darüber hinaus kann in komplexen genetischen Schaltkreisen eine Vielzahl von kontextabhängigen Problemen auftreten, die dazu führen, dass sich das Verhalten eines vollständigen Schaltkreises Vorhersagen widersetzt, die auf der Charakterisierung einzelner Teile basieren ^8,9.

Um komplexe Säugetierschaltkreise wie Zellzustandsklassifikatoren schneller zu entwickeln und zu testen, entwickelte unser Labor eine Technik namens Poly-Transfection¹⁰, eine Weiterentwicklung von Plasmid-Co-Transfektionsprotokollen. Bei der Co-Transfektion werden mehrere Plasmid-DNA-Spezies mit einem positiv geladenen Lipid- oder Polymerreagenz komplexiert und dann korreliert an die Zellen abgegeben (Abbildung 1A). Bei der Polytransfektion werden die Plasmide separat mit dem Reagenz komplexiert, so dass die DNA aus jedem Transfektionskomplex dekorreliert an die Zellen abgegeben wird (Abbildung 1B). Bei dieser Methode werden Zellen innerhalb der transfizierten Population zahlreichen Kombinationen von Verhältnissen von zwei oder mehr DNA-Nutzlasten ausgesetzt, die unterschiedliche Schaltkreiskomponenten tragen.

Um die Verhältnisse der Schaltungskomponenten zu messen, die an jede Zelle abgegeben werden, enthält jeder Transfektionskomplex innerhalb einer Polytransfektion einen konstitutiv exprimierten Fluoreszenzreporter, der als Proxy für die zelluläre Aufnahme des Komplexes dient. Füllstoff-DNA, die keine Elemente enthält, die in einer Säugetierzelle aktiv sind, wird verwendet, um die relative Menge der fluoreszierenden Reporter- und Schaltkreiskomponenten einzustellen, die in einem einzigen Transfektionskomplex an eine Zelle abgegeben werden, und wird in der Diskussion ausführlicher diskutiert. Ein Beispiel für Füllstoff-DNA, die im Weiss-Labor verwendet wird, ist ein Plasmid, das eine Terminatorsequenz enthält, aber keinen Promotor, keine kodierende Sequenz usw. Zellen mit unterschiedlichen Verhältnissen der Schaltkreiskomponenten können dann verglichen werden, um optimale Verhältnisse für die Funktion der Genschaltkreise zu finden. Dies wiederum liefert nützliche Vorhersagen für die Auswahl von Promotoren und anderen Schaltkreiselementen, um optimale Genexpressionsniveaus zu erreichen, wenn Schaltkreiskomponenten zu einem einzigen Vektor für die genetische Integration kombiniert werden (z. B. ein Lentivirus, ein Transposon oder ein Landeplatz). Anstatt also die Verhältnisse zwischen den Schaltungskomponenten auf der Grundlage von Intuition oder über einen zeitaufwändigen Trial-and-Error-Prozess zu wählen, wertet die Polytransfektion eine Vielzahl von Stöchiometrien zwischen genetischen Teilen in einer Eintopfreaktion aus.

In unserem Labor hat die Polytransfektion die Optimierung vieler genetischer Schaltkreise ermöglicht, darunter Zellklassifikatoren, Feedback- und Feedforward-Controller sowie bistabile Motive. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt die Designzyklen komplexer genetischer Schaltkreise in Säugetierzellen erheblich. Seitdem wurde die Polytransfektion verwendet, um mehrere genetische Schaltkreise zu charakterisieren, um ihre mehrdimensionalen Input-Output-Übertragungsfunktionen mit hoher Auflösung^{aufzudecken 10}, eine alternative Schaltkreistopologie für die Zellzustandsklassifizierung 11 zu optimieren und verschiedene veröffentlichte^12,13 und laufende Projekte zu beschleunigen.

Hier beschreiben und beschreiben wir den Arbeitsablauf für den Einsatz der Polytransfektion zur schnellen Optimierung eines genetischen Schaltkreises (Abbildung 2). Das Protokoll zeigt, wie qualitativ hochwertige Poly-Transfektionsdaten generiert und mehrere häufige Fehler im Poly-Transfektionsprotokoll und in der Datenanalyse vermieden werden können (Abbildung 3). Anschließend wird demonstriert, wie die Polytransfektion zur Charakterisierung einfacher Schaltungskomponenten eingesetzt werden kann und dabei die Ergebnisse der Polytransfektion mit der Co-Transfektion verglichen werden können (Abbildung 4). Schließlich zeigen die Ergebnisse der Polytransfektion eine Optimierung des Krebsklassifikatorschaltkreises (Abbildung 5).

Protocol

HINWEIS: Tabelle 1 und Tabelle 2 dienen als wichtige Referenzen für dieses Protokoll. Tabelle 1 zeigt die Skalierung der Reagenzien für Reaktionen und Tabelle 2 zeigt die Arithmetik des DNA-Verhältnisses für eine im Protokoll beschriebene Beispiel-Polytransfektion (obere Hälfte) und für ein mögliches Folgeexperiment (untere Hälfte). 1. Zellen für die Transfektion vorbereiten Stellen Sie sich…

Representative Results

In Abbildung 1 vergleichen wir die Co-Transfektion mit der Poly-Transfektion. Bei einer Co-Transfektion werden alle Plasmide in der gleichen Transfektionsmischung abgegeben, was zu einer hohen Korrelation zwischen der Menge jedes einzelnen Plasmids führt, die eine einzelne Zelle erhält (Abbildung 1A). Während die Anzahl der gesamten Plasmide, die an jede Zelle abgegeben werden, erheblich variiert, ist die Fluoreszenz der beiden Reporterproteine in den einzeln…

Discussion

Rapid-Prototyping-Methoden wie Computer-Aided Design (CAD), Breadboarding und 3D-Druck haben die Disziplinen des Maschinenbaus, der Elektrotechnik und des Bauingenieurwesens revolutioniert. Die Fähigkeit, schnell nach vielen möglichen Lösungen für eine bestimmte Herausforderung zu suchen, beschleunigt den Fortschritt in einem Bereich erheblich. Wir glauben, dass die Polytransfektion eine analoge Technologie für die Biotechnik ist, die ein schnelles Prototyping genetischer Schaltkreise ermöglicht. Darüber hinaus er…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI