Быстрое развитие схем идентификации состояния клеток с помощью политрансфекции

Summary

Сложные генетические схемы требуют много времени для проектирования, тестирования и оптимизации. Чтобы облегчить этот процесс, клетки млекопитающих трансфицируются таким образом, чтобы можно было тестировать несколько стехиометрий компонентов схемы в одной лунке. В этом протоколе описаны этапы планирования экспериментов, трансфекции и анализа данных.

Abstract

Генетические схемы млекопитающих продемонстрировали потенциал для обнаружения и лечения широкого спектра болезненных состояний, но оптимизация уровней компонентов цепи остается сложной и трудоемкой. Чтобы ускорить этот процесс, наша лаборатория разработала политрансфекцию, высокопроизводительное расширение традиционной трансфекции млекопитающих. При политрансфекции каждая клетка в трансфицированной популяции по существу выполняет свой эксперимент, проверяя поведение схемы при разных числах копий ДНК и позволяя пользователям анализировать большое количество стехиометрий в реакции с одним горшком. До сих пор были продемонстрированы политрансфекции, которые оптимизируют соотношения трехкомпонентных цепей в одной яме ячеек; В принципе, тот же метод можно использовать для разработки еще более крупных схем. Результаты политрансфекции могут быть легко применены для поиска оптимальных соотношений ДНК и котрансфекта для переходных цепей или для выбора уровней экспрессии компонентов схемы для генерации стабильных клеточных линий.

Здесь мы демонстрируем использование политрансфекции для оптимизации трехкомпонентной схемы. Протокол начинается с принципов экспериментального дизайна и объясняет, как политрансфекция основывается на традиционных методах совместной трансфекции. Далее проводится политрансфекция клеток с последующей проточной цитометрией через несколько дней. Наконец, данные анализируются путем изучения срезов данных одноклеточной проточной цитометрии, которые соответствуют подмножествам клеток с определенными соотношениями компонентов. В лаборатории политрансфекция использовалась для оптимизации клеточных классификаторов, контроллеров обратной связи и прямой связи, бистабильных мотивов и многого другого. Этот простой, но мощный метод ускоряет циклы проектирования сложных генетических схем в клетках млекопитающих.

Introduction

Область синтетической биологии млекопитающих быстро прогрессировала: от разработки простых частей восприятия и ответа в культивируемых клеточных линиях до оптимизации сложных сетей генов для решения реальных проблем в диагностике и терапии¹. Эти сложные схемы способны воспринимать биологические входы от профилей микроРНК до цитокинов и низкомолекулярных лекарств, а также реализовывать схемы логической обработки, включая транзисторы, полосовые фильтры, тумблеры и осцилляторы. Они также показали многообещающие результаты на животных моделях таких заболеваний, как рак, артрит, диабет и многих других 1,2,3,4,5. Однако по мере роста сложности схемы оптимизация уровней каждого из ее компонентов становится все более сложной задачей.

Одним из особенно полезных типов генетической схемы является классификатор клеток, который может быть запрограммирован на восприятие и реагирование на клеточные состояния. Селективная продукция белков или выходов РНК в определенных клеточных состояниях является мощным инструментом для направления и программирования дифференцировки клеток и органоидов, выявления и уничтожения больных клеток и/или нежелательных типов клеток, а также регулирования функции терапевтических клеток 1,2,3,4,5 . Однако создание схем в клетках млекопитающих, которые могут точно классифицировать клеточные состояния из нескольких клеточных видов РНК и / или белков, было очень сложной задачей.

Одним из наиболее трудоемких этапов разработки схемы классификации клеток является оптимизация относительных уровней экспрессии отдельных генов компонентов, таких как датчики и факторы обработки, в схеме. Чтобы ускорить оптимизацию схем и позволить строить более сложные схемы, в недавних работах использовалось математическое моделирование схем классификаторов ячеек и их компонентов для прогнозирования оптимальных составов и топологий ^6,7. Несмотря на то, что до сих пор это показало мощные результаты, математический анализ ограничен необходимостью систематической характеристики поведения входа-вывода генов компонентов в схеме, что отнимает много времени. Кроме того, в сложных генетических схемах может возникнуть множество контекстно-зависимых проблем, в результате чего поведение полной схемы не поддается предсказаниям, основанным на характеристиках отдельных частей ^8,9.

Для более быстрой разработки и тестирования сложных схем млекопитающих, таких как классификаторы состояния клеток, наша лаборатория разработала метод, называемый политрансфекцией¹⁰, эволюцию протоколов плазмидной котрансфекции. При совместной трансфекции несколько видов плазмидной ДНК комплексируются вместе с положительно заряженным липидным или полимерным реагентом, а затем доставляются в клетки коррелированным образом (рис. 1A). При политрансфекции плазмиды отдельно образуют комплекс с реагентом, так что ДНК из каждого трансфекционного комплекса доставляется в клетки декоррелированным образом (рис. 1B). Используя этот метод, клетки в трансфицированной популяции подвергаются воздействию многочисленных комбинаций соотношений двух или более полезных нагрузок ДНК, несущих различные компоненты схемы.

Для измерения соотношений компонентов цепи, доставляемых в каждую ячейку, каждый трансфекционный комплекс в политрансфекции содержит конститутивно экспрессируемый флуоресцентный репортер, который служит прокси для клеточного поглощения комплекса. ДНК-наполнитель, которая не содержит каких-либо элементов, активных в клетке млекопитающих, используется для настройки относительного количества флуоресцентного репортера и компонентов схемы, доставляемых в клетку в одном трансфекционном комплексе, и более подробно обсуждается в обсуждении. Примером ДНК-наполнителя, используемой в лаборатории Вайса, является плазмида, содержащая последовательность терминатора, но без промотора, кодирующей последовательности и т. д. Затем можно сравнить клетки с различными соотношениями компонентов цепи, чтобы найти оптимальные соотношения для функции генной цепи. Это, в свою очередь, дает полезные прогнозы для выбора промоторов и других элементов схемы для достижения оптимальных уровней экспрессии генов при объединении компонентов схемы в единый вектор для генетической интеграции (например, лентивирус, транспозон или посадочная площадка). Таким образом, вместо того, чтобы выбирать соотношения между компонентами схемы на основе интуиции или с помощью трудоемкого процесса проб и ошибок, политрансфекция оценивает широкий спектр стехиометрий между генетическими частями в реакции с одним горшком.

В нашей лаборатории политрансфекция позволила оптимизировать многие генетические схемы, включая классификаторы клеток, контроллеры обратной связи и прямой связи, а также бистабильные мотивы. Этот простой, но мощный метод значительно ускоряет циклы проектирования сложных генетических схем в клетках млекопитающих. С тех пор политрансфекция использовалась для характеристики нескольких генетических цепей, чтобы выявить их многомерные функции передачи ввода-вывода с высоким разрешением¹⁰, оптимизировать альтернативную топологию схемы для классификации состояния клетки 11 и ускорить различные опубликованные^12,13 и текущие проекты.

Здесь мы описываем и изображаем рабочий процесс использования политрансфекции для быстрой оптимизации генетической цепи (рис. 2). Протокол показывает, как генерировать высококачественные данные политрансфекции и избежать нескольких распространенных ошибок в протоколе политрансфекции и анализе данных (рис. 3). Затем он демонстрирует, как использовать политрансфекцию для характеристики простых компонентов схемы и, в процессе, сравнивать результаты политрансфекции с совместной трансфекцией (рис. 4). Наконец, результаты политрансфекции показывают оптимизацию схемы классификатора рака (рис. 5).

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Таблицы 1 и 2 служат важными ссылками для этого протокола. В таблице 1 показано масштабирование реагентов для реакций, а в таблице 2 показана арифметика соотношения ДНК для примера политрансфекции, описанной в протоколе (верхняя половина), …

Representative Results

На рисунке 1 мы сравниваем котрансфекцию с политрансфекцией. При совместной трансфекции все плазмиды доставляются в одну и ту же смесь для трансфекции, что приводит к высокой корреляции между количеством каждой плазмиды, получаемой любой отдельной клеткой (?…

Discussion

Методы быстрого прототипирования, такие как автоматизированное проектирование (САПР), макетирование и 3D-печать, произвели революцию в механических, электрических и гражданских инженерных дисциплинах. Возможность быстрого поиска среди множества возможных решений данной проблемы зна?…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI