פיתוח מהיר של מעגלי זיהוי מצב התא עם Poly-Transfection
Summary
מעגלים גנטיים מורכבים גוזלים זמן רב כדי לתכנן, לבדוק ולמטב. כדי להקל על תהליך זה, תאי יונקים נדבקים באופן המאפשר בדיקה של סטויכיומטריה מרובים של רכיבי מעגל בבאר אחת. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לתכנון ניסויים, טרנספקציה וניתוח נתונים.
Abstract
מעגלים גנטיים של יונקים הוכיחו את הפוטנציאל לחוש ולטפל במגוון רחב של מצבי מחלה, אך אופטימיזציה של רמות רכיבי המעגלים נותרה מאתגרת ודורשת עבודה. כדי להאיץ את התהליך הזה, המעבדה שלנו פיתחה פולי-טרנספקציה, הרחבה בעלת תפוקה גבוהה של טרנספקציה מסורתית של יונקים. בפולי-טרנספקציה, כל תא באוכלוסייה הנגועה מבצע למעשה ניסוי שונה, בודק את התנהגות המעגל במספרי העתקי דנ”א שונים ומאפשר למשתמשים לנתח מספר רב של סטויכיומטריה בתגובה חד-סירית. עד כה הודגמו פולי-טרנספקציות הממטבות את היחסים של מעגלים תלת-רכיביים בבאר תאים אחת; באופן עקרוני, אותה שיטה יכולה לשמש לפיתוח מעגלים גדולים עוד יותר. ניתן ליישם בקלות תוצאות פולי-טרנספקציה כדי למצוא יחסים אופטימליים בין דנ”א לטרנספקט משותף עבור מעגלים חולפים או כדי לבחור רמות ביטוי עבור רכיבי מעגלים ליצירת קווי תאים יציבים.
כאן, אנו מדגימים את השימוש בפולי-טרנספקציה כדי לייעל מעגל בן שלושה רכיבים. הפרוטוקול מתחיל בעקרונות תכנון ניסיוני ומסביר כיצד פולי-טרנספקציה מתבססת על שיטות מסורתיות של קו-טרנספקציה. לאחר מכן, poly-transfection של תאים מתבצעת ואחריו cytometry זרימה כמה ימים מאוחר יותר. לבסוף, הנתונים מנותחים על ידי בחינת פרוסות של נתוני ציטומטריית זרימה של תא בודד המתאימים לתת-קבוצות של תאים עם יחסי רכיבים מסוימים. במעבדה, פולי-טרנספקציה שימשה לאופטימיזציה של מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, מוטיבים דו-יציבים ורבים אחרים. שיטה פשוטה אך רבת עוצמה זו מאיצה את מחזורי התכנון של מעגלים גנטיים מורכבים בתאי יונקים.
Introduction
תחום הביולוגיה הסינתטית של יונקים התקדם במהירות, מפיתוח חלקים פשוטים של חישה ותגובה בקווי תאים בתרבית ועד אופטימיזציה של רשתות גנים מורכבות כדי להתמודד עם אתגרים בעולם האמיתי באבחון ובטיפול1. מעגלים מתוחכמים אלה מסוגלים לחוש קלט ביולוגי מפרופילי מיקרו-רנ”א, דרך ציטוקינים ועד תרופות של מולקולות קטנות, וליישם מעגלי עיבוד לוגיים הכוללים טרנזיסטורים, מסנני פסים, מתגי החלפה ומתנדים. הם גם הראו תוצאות מבטיחות במודלים של בעלי חיים של מחלות כמו סרטן, דלקת פרקים, סוכרת, ועודרבים 1,2,3,4,5. עם זאת, ככל שהמורכבות של מעגל גדלה, אופטימיזציה של הרמות של כל אחד ממרכיביו הופכת מאתגרת יותר ויותר.
סוג אחד שימושי במיוחד של מעגל גנטי הוא מסווג תאים, אשר ניתן לתכנת לחוש ולהגיב למצבים תאיים. ייצור סלקטיבי של תפוקות חלבון או RNA במצבים תאיים ספציפיים הוא כלי רב עוצמה להנחיה ותכנות התמיינות של תאים ואורגנואידים, לזהות ולהשמיד תאים חולים ו / או סוגי תאים לא רצויים, ולווסת את תפקודם של תאים טיפוליים 1,2,3,4,5 . עם זאת, יצירת מעגלים בתאי יונקים שיכולים לסווג במדויק מצבי תאים ממספר מיני רנ”א תאיים ו/או חלבונים הייתה מאתגרת ביותר.
אחד השלבים הגוזלים זמן רב ביותר בפיתוח מעגל סיווג תאים הוא לייעל את רמות הביטוי היחסי של גנים המרכיבים רכיבים בודדים, כגון חיישנים וגורמי עיבוד, בתוך המעגל. כדי להאיץ את אופטימיזציה של מעגלים ולאפשר בנייה של מעגלים מתוחכמים יותר, עבודה אחרונה השתמשה במידול מתמטי של מעגלים מסווגי תאים ומרכיביהם כדי לחזות הרכבים וטופולוגיות אופטימליים 6,7. בעוד שזה הראה תוצאות חזקות עד כה, ניתוח מתמטי מוגבל על ידי הצורך לאפיין באופן שיטתי את התנהגות הקלט-פלט של גנים המרכיבים במעגל, אשר גוזל זמן. יתר על כן, מספר עצום של בעיות תלויות הקשר יכולות להופיע במעגלים גנטיים מורכבים, ולגרום להתנהגות של מעגל מלא להתריס נגד תחזיות המבוססות על אפיונים של חלקים בודדים 8,9.
כדי לפתח ולבדוק במהירות רבה יותר מעגלים מורכבים של יונקים כגון מסווגי מצב תאים, המעבדה שלנו פיתחה טכניקה הנקראת poly-transfection10, אבולוציה של פרוטוקולי טרנספקציה משותפת של פלסמיד. בטרנספקציה משותפת, מיני דנ”א פלסמידים מרובים מורכבים יחד עם מגיב שומנים או פולימר טעון חיובית, ואז מועברים לתאים באופן מתואם (איור 1A). בפולי-טרנספקציה, פלסמידים מורכבים בנפרד עם המגיב, כך שהדנ”א מכל קומפלקס טרנספקציה מועבר לתאים באופן דה-קורלציה (איור 1B). באמצעות שיטה זו, תאים בתוך האוכלוסייה הנגועה נחשפים לשילובים רבים של יחסים של שני מטעני דנ”א או יותר הנושאים רכיבי מעגל שונים.
כדי למדוד את היחסים בין רכיבי המעגלים המועברים לכל תא, כל קומפלקס טרנספקציה בתוך פולי-טרנספקציה מכיל כתב פלואורסצנטי מבוטא באופן קונסטיטוטיבי המשמש כפרוקסי לקליטה תאית של המכלול. דנ”א מילוי שאינו מכיל יסודות הפעילים בתוך תא יונק משמש לכוונון הכמות היחסית של רכיבי הכתב הפלואורסצנטי והמעגלים המועברים לתא בקומפלקס טרנספקציה יחיד ונדון ביתר פירוט בדיון. דוגמה לדנ”א מילוי המשמש במעבדת וייס הוא פלסמיד המכיל רצף טרמינטור, אך ללא פרומוטור, רצף קידוד וכו’. לאחר מכן ניתן להשוות תאים עם יחסים שונים של רכיבי מעגל כדי למצוא יחסים אופטימליים לתפקוד מעגל הגנים. זה בתורו מניב תחזיות שימושיות לבחירת מקדמים ורכיבי מעגל אחרים כדי להשיג רמות ביטוי גנים אופטימליות בעת שילוב רכיבי מעגל לווקטור יחיד לאינטגרציה גנטית (למשל, לנטיוירוס, טרנספוזון או משטח נחיתה). לכן, במקום לבחור יחסים בין רכיבי מעגל בהתבסס על אינטואיציה או באמצעות תהליך ניסוי וטעייה הגוזל זמן, פולי-טרנספקציה מעריכה מגוון רחב של סטויכיומטריה בין חלקים גנטיים בתגובה חד-סירית.
במעבדה שלנו, פולי-טרנספקציה אפשרה אופטימיזציה של מעגלים גנטיים רבים, כולל מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, ומוטיבים דו-יציבים. שיטה פשוטה אך רבת עוצמה זו מאיצה באופן משמעותי את מחזורי התכנון של מעגלים גנטיים מורכבים בתאי יונקים. פולי-טרנספקציה שימשה מאז לאפיון מספר מעגלים גנטיים כדי לחשוף את פונקציות העברת הקלט-פלט הרב-ממדיות שלהם ברזולוציה גבוהה 10, לייעל טופולוגיית מעגל חלופית עבור סיווג מצב התא11, ולהאיץ פרויקטים שונים שפורסמו12,13 ומתמשכים.
כאן אנו מתארים ומתארים את זרימת העבודה לשימוש בפולי-טרנספקציה כדי למטב במהירות מעגל גנטי (איור 2). הפרוטוקול מראה כיצד להפיק נתוני פולי-טרנספקציה באיכות גבוהה ולהימנע ממספר שגיאות נפוצות בפרוטוקול הפולי-טרנספקציה ובניתוח הנתונים (איור 3). לאחר מכן הוא מדגים כיצד להשתמש בפולי-טרנספקציה כדי לאפיין רכיבי מעגלים פשוטים, ותוך כדי כך, למדוד תוצאות פולי-טרנספקציה כנגד קו-טרנספקציה (איור 4). לבסוף, התוצאות של פולי-טרנספקציה מראות אופטימיזציה של מעגל מסווג הסרטן (איור 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות אב טיפוס מהירות כגון תכנון בעזרת מחשב (CAD), breadboarding והדפסה תלת-ממדית חוללו מהפכה בתחומי המכניקה, החשמל וההנדסה האזרחית. היכולת לחפש במהירות פתרונות אפשריים רבים לאתגר נתון מאיצה מאוד את ההתקדמות בתחום. אנו מאמינים כי פולי-טרנספקציה היא טכנולוגיה מקבילה להנדסה ביולוגית, המאפשרת אב טיפ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחברי מעבדת וייס לשעבר שהובילו או תרמו לפיתוח שיטת הפולי-טרנספקציה ויישומה על מסווגי תאים: ג’רמי גאם, בר דיאנדרת’ וג’ין הא; חברי מעבדה נוספים של וייס שתרמו לפיתוח/אופטימיזציה נוספים של השיטה: וונלונג שו, ליי וואנג וכריסטיאן קובה-סמאניגו; פרופ’ ג’וש לאונרד וחברי הקבוצה, כולל פטריק דונהיו והיילי אדלשטיין, על בדיקת פולי-טרנספקציה ומתן משוב; ופרופ’ ניקה שכיבה, שהזמינה את כתב היד הזה ונתנה משוב. ברצוננו להודות גם למכונים הלאומיים לבריאות [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]; הקרן הלאומית למדע [1745645]; מענק תמיכה (ליבה) של מרכז הסרטן [P30CCA14051, בחלקו] מה- NCI, ומהמכונים הלאומיים לבריאות [P50GM098792] למימון עבודה זו.
Materials
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
Referenzen
- Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
- Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
- Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
- Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
- Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444 (2010).
- Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
- Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
- Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
- Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
- Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A ‘poly-transfection’ method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106 (2019).
- Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720 (2022).
- Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690 (2020).
- DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582 (2022).
- Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641 (2020).
- Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , (2012).
- Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
- Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
- Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
- Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818 (2019).
- Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
- Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
- Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
- Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
- Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
- Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).
