Rápido Desenvolvimento de Circuitos de Identificação do Estado Celular com Poli-Transfecção

Summary

Circuitos genéticos complexos são demorados para projetar, testar e otimizar. Para facilitar esse processo, células de mamíferos são transfectadas de forma a permitir o teste de múltiplas estequiometrias de componentes do circuito em um único poço. Este protocolo descreve as etapas para o planejamento experimental, transfecção e análise dos dados.

Abstract

Circuitos genéticos de mamíferos têm demonstrado o potencial para detectar e tratar uma ampla gama de estados de doenças, mas a otimização dos níveis de componentes do circuito permanece desafiadora e trabalhosa. Para acelerar esse processo, nosso laboratório desenvolveu a politransfecção, uma extensão de alto rendimento da transfecção tradicional de mamíferos. Na politransfecção, cada célula da população transfectada realiza essencialmente um experimento diferente, testando o comportamento do circuito em diferentes números de cópias de DNA e permitindo que os usuários analisem um grande número de estequiometrias em uma reação de pote único. Até o momento, foram demonstradas politransfecções que otimizam as proporções de circuitos de três componentes em um único poço de células; Em princípio, o mesmo método pode ser usado para o desenvolvimento de circuitos ainda maiores. Os resultados da politransfecção podem ser facilmente aplicados para encontrar proporções ótimas de DNA para co-transfect para circuitos transientes ou para escolher níveis de expressão para componentes de circuitos para a geração de linhagens celulares estáveis.

Aqui, demonstramos o uso da politransfecção para otimizar um circuito de três componentes. O protocolo começa com princípios de planejamento experimental e explica como a politransfecção se baseia em métodos tradicionais de cotransfecção. Em seguida, a politransfecção das células é realizada e seguida por citometria de fluxo alguns dias depois. Finalmente, os dados são analisados examinando fatias dos dados de citometria de fluxo de célula única que correspondem a subconjuntos de células com determinadas razões de componentes. No laboratório, a politransfecção tem sido usada para otimizar classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos biestáveis e muito mais. Este método simples, mas poderoso, acelera os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos.

Introduction

O campo da biologia sintética de mamíferos progrediu rapidamente, desde o desenvolvimento de partes simples de sentido e resposta em linhagens celulares cultivadas até a otimização de redes complexas de genes para enfrentar desafios do mundo real em diagnóstico e terapêutica¹. Esses circuitos sofisticados são capazes de detectar entradas biológicas de perfis de microRNA a citocinas e pequenas moléculas de fármacos, e implementar circuitos de processamento lógico, incluindo transistores, filtros passa-banda, chaves de alternância e osciladores. Também têm mostrado resultados promissores em modelos animais de doenças como câncer, artrite, diabetes e muitas outras 1,2,3,4,5. No entanto, à medida que a complexidade de um circuito cresce, otimizar os níveis de cada um de seus componentes torna-se cada vez mais desafiador.

Um tipo particularmente útil de circuito genético é um classificador celular, que pode ser programado para detectar e responder a estados celulares. A produção seletiva de proteínas ou RNA em estados celulares específicos é uma ferramenta poderosa para orientar e programar a diferenciação de células e organoides, identificar e destruir células doentes e/ou tipos celulares indesejáveis e regular a função de células terapêuticas 1,2,3,4,5 . No entanto, a criação de circuitos em células de mamíferos que possam classificar com precisão os estados celulares de várias espécies de RNA e/ou proteínas celulares tem sido altamente desafiadora.

Uma das etapas mais demoradas do desenvolvimento de um circuito de classificação celular é otimizar os níveis de expressão relativa de genes de componentes individuais, como sensores e fatores de processamento, dentro do circuito. Para acelerar a otimização de circuitos e permitir a construção de circuitos mais sofisticados, trabalhos recentes têm utilizado a modelagem matemática de circuitos classificadores de células e seus componentes para prever composições e topologias ótimas ^6,7. Embora isso tenha mostrado resultados poderosos até agora, a análise matemática é limitada pela necessidade de caracterizar sistematicamente o comportamento de entrada-saída de genes componentes no circuito, o que é demorado. Além disso, uma miríade de problemas dependentes do contexto pode surgir em circuitos genéticos complexos, fazendo com que o comportamento de um circuito completo desafie as previsões baseadas em caracterizações de partes individuais ^8,9.

Para desenvolver e testar mais rapidamente circuitos complexos de mamíferos, como classificadores de estado celular, nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada politransfecção¹⁰, uma evolução dos protocolos de cotransfecção de plasmídeos. Na co-transfecção, múltiplas espécies de DNA plasmidial são complexadas juntamente com um reagente lipídico ou polimérico carregado positivamente e, em seguida, entregues às células de forma correlacionada (Figura 1A). Na politransfecção, os plasmídeos são complexados separadamente com o reagente, de modo que o DNA de cada complexo de transfecção é entregue às células de forma descorrelacionada (Figura 1B). Usando este método, as células dentro da população transfectada são expostas a numerosas combinações de razões de duas ou mais cargas úteis de DNA carregando diferentes componentes do circuito.

Para medir as proporções dos componentes do circuito entregues a cada célula, cada complexo de transfecção dentro de uma politransfecção contém um repórter fluorescente constitutivamente expresso que serve como um proxy para a captação celular do complexo. O DNA de preenchimento que não contém nenhum elemento ativo dentro de uma célula de mamífero é usado para ajustar a quantidade relativa do repórter fluorescente e dos componentes do circuito entregues a uma célula em um único complexo de transfecção e é discutido com mais detalhes na discussão. Um exemplo de DNA de preenchimento usado no laboratório de Weiss é um plasmídeo contendo uma sequência de terminador, mas sem promotor, sequência codificadora, etc. Células com diferentes proporções de componentes do circuito podem então ser comparadas para encontrar razões ideais para a função do circuito gênico. Isso, por sua vez, produz previsões úteis para a escolha de promotores e outros elementos do circuito para alcançar níveis ideais de expressão gênica ao combinar componentes do circuito em um único vetor para integração genética (por exemplo, um lentivírus, transposon ou plataforma de pouso). Assim, em vez de escolher razões entre componentes do circuito com base na intuição ou através de um processo demorado de tentativa e erro, a politransfecção avalia uma ampla gama de estequiometrias entre partes genéticas em uma reação de pote único.

Em nosso laboratório, a politransfecção permitiu a otimização de muitos circuitos genéticos, incluindo classificadores celulares, controladores de feedback e feedforward e motivos biestáveis. Este método simples, mas poderoso, acelera significativamente os ciclos de projeto de circuitos genéticos complexos em células de mamíferos. Desde então, a politransfecção tem sido usada para caracterizar vários circuitos genéticos para revelar suas funções multidimensionais de transferência de entrada-saída em alta resolução¹⁰, otimizar uma topologia de circuito alternativo para classificação de estado celular 11 e acelerar vários projetos publicados^12,13 e em andamento.

Aqui descrevemos e descrevemos o fluxo de trabalho para o uso da politransfecção para otimizar rapidamente um circuito genético (Figura 2). O protocolo mostra como gerar dados de politransfecção de alta qualidade e evitar vários erros comuns no protocolo de politransfecção e na análise dos dados (Figura 3). Em seguida, demonstra como usar a politransfecção para caracterizar componentes de circuitos simples e, no processo, comparar os resultados da politransfecção com a cotransfecção (Figura 4). Finalmente, os resultados da politransfecção mostram otimização do circuito classificador de câncer (Figura 5).

Protocol

NOTA: A Tabela 1 e a Tabela 2 servem como referências significativas para este protocolo. A Tabela 1 mostra a escala de reagentes para as reações, e a Tabela 2 mostra a aritmética da razão de DNA para um exemplo de politransfecção descrito no protocolo (metade superior) e para um possível experimento de seguimento (metade inferior). 1. Preparação das células para transfecção Certifique-s…

Representative Results

Na Figura 1, comparamos a co-transfecção com a politransfecção. Em uma co-transfecção, todos os plasmídeos são liberados na mesma mistura de transfecção, resultando em alta correlação entre a quantidade de cada plasmídeo que uma única célula recebe (Figura 1A). Enquanto o número de plasmídeos totais entregues a cada célula varia significativamente, a fluorescência das duas proteínas repórteres nas células individuais em toda a população e…

Discussion

Métodos de prototipagem rápida, como CAD (computer-aided design), protoboard e impressão 3D, revolucionaram as disciplinas de engenharia mecânica, elétrica e civil. A capacidade de pesquisar rapidamente muitas soluções possíveis para um determinado desafio acelera muito o progresso em um campo. Acreditamos que a politransfecção é uma tecnologia análoga para a engenharia biológica, permitindo a prototipagem rápida de circuitos genéticos. Além disso, outras tecnologias de prototipagem rápida requerem itera…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI