Komplexe genetische Schaltkreise sind zeitaufwändig zu entwerfen, zu testen und zu optimieren. Um diesen Prozess zu erleichtern, werden Säugetierzellen so transfiziert, dass mehrere Stöchiometrien von Schaltungskomponenten in einem einzigen Well getestet werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die experimentelle Planung, Transfektion und Datenanalyse.
Genetische Schaltkreise von Säugetieren haben gezeigt, dass sie das Potenzial haben, eine Vielzahl von Krankheitszuständen zu erkennen und zu behandeln, aber die Optimierung der Ebenen von Schaltkreiskomponenten bleibt herausfordernd und arbeitsintensiv. Um diesen Prozess zu beschleunigen, hat unser Labor die Poly-Transfektion entwickelt, eine Hochdurchsatz-Erweiterung der traditionellen Transfektion von Säugetieren. Bei der Polytransfektion führt jede Zelle in der transfizierten Population im Wesentlichen ein anderes Experiment durch, bei dem das Verhalten des Schaltkreises bei unterschiedlichen DNA-Kopienzahlen getestet wird und die Benutzer eine große Anzahl von Stöchiometrien in einer Eintopfreaktion analysieren können. Bisher wurden Poly-Transfektionen demonstriert, die das Verhältnis von Drei-Komponenten-Schaltkreisen in einem einzigen Zelltopf optimieren. Prinzipiell kann die gleiche Methode für die Entwicklung noch größerer Schaltungen verwendet werden. Die Ergebnisse der Polytransfektion können leicht angewendet werden, um optimale Verhältnisse von DNA zu Co-Transfektion für transiente Schaltkreise zu finden oder um Expressionsniveaus für Schaltkreiskomponenten für die Erzeugung stabiler Zelllinien zu wählen.
Hier demonstrieren wir den Einsatz von Poly-Transfektion zur Optimierung einer Drei-Komponenten-Schaltung. Das Protokoll beginnt mit experimentellen Designprinzipien und erklärt, wie die Poly-Transfektion auf traditionellen Co-Transfektionsmethoden aufbaut. Als nächstes wird die Polytransfektion der Zellen durchgeführt und einige Tage später eine Durchflusszytometrie durchgeführt. Schließlich werden die Daten analysiert, indem Schichten der Einzelzell-Durchflusszytometriedaten untersucht werden, die Teilmengen von Zellen mit bestimmten Komponentenverhältnissen entsprechen. Im Labor wurde die Polytransfektion zur Optimierung von Zellklassifikatoren, Rückkopplungs- und Feedforward-Controllern, bistabilen Motiven und vielem mehr eingesetzt. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt Designzyklen für komplexe genetische Schaltkreise in Säugetierzellen.
Das Gebiet der synthetischen Biologie von Säugetieren hat sich rasant weiterentwickelt, von der Entwicklung einfacher Sense-and-Response-Teile in kultivierten Zelllinien bis hin zur Optimierung komplexer Netzwerke von Genen, um reale Herausforderungen in der Diagnostik und Therapie anzugehen1. Diese ausgeklügelten Schaltkreise sind in der Lage, biologische Eingaben von microRNA-Profilen über Zytokine bis hin zu niedermolekularen Medikamenten zu erfassen und logische Verarbeitungsschaltkreise wie Transistoren, Bandpassfilter, Kippschalter und Oszillatoren zu implementieren. Sie haben auch vielversprechende Ergebnisse in Tiermodellen für Krankheiten wie Krebs, Arthritis, Diabetes und viele mehr gezeigt 1,2,3,4,5. Mit zunehmender Komplexität einer Schaltung wird es jedoch immer schwieriger, die Pegel der einzelnen Komponenten zu optimieren.
Eine besonders nützliche Art von genetischem Schaltkreis ist ein Zellklassifikator, der so programmiert werden kann, dass er zelluläre Zustände erkennt und darauf reagiert. Die selektive Produktion von Protein- oder RNA-Outputs in bestimmten zellulären Zuständen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Differenzierung von Zellen und Organoiden zu steuern und zu programmieren, kranke Zellen und/oder unerwünschte Zelltypen zu identifizieren und zu zerstören und die Funktion therapeutischer Zellen zu regulieren 1,2,3,4,5 . Die Schaffung von Schaltkreisen in Säugetierzellen, die Zellzustände aus mehreren zellulären RNA- und/oder Proteinspezies genau klassifizieren können, war jedoch eine große Herausforderung.
Einer der zeitaufwändigsten Schritte bei der Entwicklung eines Zellklassifizierungsschaltkreises besteht darin, die relativen Expressionsniveaus einzelner Komponentengene, wie z. B. Sensoren und Verarbeitungsfaktoren, innerhalb des Schaltkreises zu optimieren. Um die Schaltungsoptimierung zu beschleunigen und den Aufbau anspruchsvollerer Schaltkreise zu ermöglichen, wurde in neueren Arbeiten die mathematische Modellierung von Zellklassifikatorschaltungen und deren Komponenten verwendet, um optimale Zusammensetzungen und Topologien vorherzusagen 6,7. Während dies bisher starke Ergebnisse gezeigt hat, ist die mathematische Analyse durch die Notwendigkeit begrenzt, das Input-Output-Verhalten von Komponentengenen in der Schaltung systematisch zu charakterisieren, was zeitaufwändig ist. Darüber hinaus kann in komplexen genetischen Schaltkreisen eine Vielzahl von kontextabhängigen Problemen auftreten, die dazu führen, dass sich das Verhalten eines vollständigen Schaltkreises Vorhersagen widersetzt, die auf der Charakterisierung einzelner Teile basieren 8,9.
Um komplexe Säugetierschaltkreise wie Zellzustandsklassifikatoren schneller zu entwickeln und zu testen, entwickelte unser Labor eine Technik namens Poly-Transfection10, eine Weiterentwicklung von Plasmid-Co-Transfektionsprotokollen. Bei der Co-Transfektion werden mehrere Plasmid-DNA-Spezies mit einem positiv geladenen Lipid- oder Polymerreagenz komplexiert und dann korreliert an die Zellen abgegeben (Abbildung 1A). Bei der Polytransfektion werden die Plasmide separat mit dem Reagenz komplexiert, so dass die DNA aus jedem Transfektionskomplex dekorreliert an die Zellen abgegeben wird (Abbildung 1B). Bei dieser Methode werden Zellen innerhalb der transfizierten Population zahlreichen Kombinationen von Verhältnissen von zwei oder mehr DNA-Nutzlasten ausgesetzt, die unterschiedliche Schaltkreiskomponenten tragen.
Um die Verhältnisse der Schaltungskomponenten zu messen, die an jede Zelle abgegeben werden, enthält jeder Transfektionskomplex innerhalb einer Polytransfektion einen konstitutiv exprimierten Fluoreszenzreporter, der als Proxy für die zelluläre Aufnahme des Komplexes dient. Füllstoff-DNA, die keine Elemente enthält, die in einer Säugetierzelle aktiv sind, wird verwendet, um die relative Menge der fluoreszierenden Reporter- und Schaltkreiskomponenten einzustellen, die in einem einzigen Transfektionskomplex an eine Zelle abgegeben werden, und wird in der Diskussion ausführlicher diskutiert. Ein Beispiel für Füllstoff-DNA, die im Weiss-Labor verwendet wird, ist ein Plasmid, das eine Terminatorsequenz enthält, aber keinen Promotor, keine kodierende Sequenz usw. Zellen mit unterschiedlichen Verhältnissen der Schaltkreiskomponenten können dann verglichen werden, um optimale Verhältnisse für die Funktion der Genschaltkreise zu finden. Dies wiederum liefert nützliche Vorhersagen für die Auswahl von Promotoren und anderen Schaltkreiselementen, um optimale Genexpressionsniveaus zu erreichen, wenn Schaltkreiskomponenten zu einem einzigen Vektor für die genetische Integration kombiniert werden (z. B. ein Lentivirus, ein Transposon oder ein Landeplatz). Anstatt also die Verhältnisse zwischen den Schaltungskomponenten auf der Grundlage von Intuition oder über einen zeitaufwändigen Trial-and-Error-Prozess zu wählen, wertet die Polytransfektion eine Vielzahl von Stöchiometrien zwischen genetischen Teilen in einer Eintopfreaktion aus.
In unserem Labor hat die Polytransfektion die Optimierung vieler genetischer Schaltkreise ermöglicht, darunter Zellklassifikatoren, Feedback- und Feedforward-Controller sowie bistabile Motive. Diese einfache, aber wirkungsvolle Methode beschleunigt die Designzyklen komplexer genetischer Schaltkreise in Säugetierzellen erheblich. Seitdem wurde die Polytransfektion verwendet, um mehrere genetische Schaltkreise zu charakterisieren, um ihre mehrdimensionalen Input-Output-Übertragungsfunktionen mit hoher Auflösungaufzudecken 10, eine alternative Schaltkreistopologie für die Zellzustandsklassifizierung 11 zu optimieren und verschiedene veröffentlichte12,13 und laufende Projekte zu beschleunigen.
Hier beschreiben und beschreiben wir den Arbeitsablauf für den Einsatz der Polytransfektion zur schnellen Optimierung eines genetischen Schaltkreises (Abbildung 2). Das Protokoll zeigt, wie qualitativ hochwertige Poly-Transfektionsdaten generiert und mehrere häufige Fehler im Poly-Transfektionsprotokoll und in der Datenanalyse vermieden werden können (Abbildung 3). Anschließend wird demonstriert, wie die Polytransfektion zur Charakterisierung einfacher Schaltungskomponenten eingesetzt werden kann und dabei die Ergebnisse der Polytransfektion mit der Co-Transfektion verglichen werden können (Abbildung 4). Schließlich zeigen die Ergebnisse der Polytransfektion eine Optimierung des Krebsklassifikatorschaltkreises (Abbildung 5).
Rapid-Prototyping-Methoden wie Computer-Aided Design (CAD), Breadboarding und 3D-Druck haben die Disziplinen des Maschinenbaus, der Elektrotechnik und des Bauingenieurwesens revolutioniert. Die Fähigkeit, schnell nach vielen möglichen Lösungen für eine bestimmte Herausforderung zu suchen, beschleunigt den Fortschritt in einem Bereich erheblich. Wir glauben, dass die Polytransfektion eine analoge Technologie für die Biotechnik ist, die ein schnelles Prototyping genetischer Schaltkreise ermöglicht. Darüber hinaus er…
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten uns bei ehemaligen Mitgliedern des Weiss Labs bedanken, die die Poly-Transfektionsmethode und ihre Anwendung auf Zellklassifikatoren geleitet oder dazu beigetragen haben: Jeremy Gam, Bre DiAndreth und Jin Huh; weitere Weiss-Labormitglieder, die zur weiteren Methodenentwicklung/-optimierung beigetragen haben: Wenlong Xu, Lei Wang und Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard und Gruppenmitglieder, darunter Patrick Donahue und Hailey Edelstein, für die Prüfung der Polytransfektion und die Bereitstellung von Feedback; und Prof. Nika Shakiba für die Einladung zu diesem Manuskript und das Feedback. Wir möchten uns auch bei den National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] bedanken; Nationale Wissenschaftsstiftung [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, teilweise] vom NCI und den National Institutes of Health [P50GM098792] zur Finanzierung dieser Arbeit.
15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Trypsin | VWR | 25-053-CI |