PCR de worm único: um método para extrair e amplificar o DNA genômico

Abstract

Fonte: Prior, H., et al. Um pipeline rápido e facil para gerar mutantes de ponto genômico em C. elegans usando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (2018). 

Este vídeo descreve uma técnica para testar rapidamente um único nematoide para um marcador genético por triagem PCR. No protocolo de exemplo, nós examinamos para edição de genoma baseada em CRISPR.

Protocol

O protocolo a seguir é um trecho de Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018). PCR e Genotipagem de Worm Único Após 1 – 2 dias de colocação de ovos, transfira o F1s para tampas individuais de tubo de tira PCR contendo 7 μL de Wor…

Representative Results

Figura 1. Engenharia CRISPR-Cas9 dolócus C. eleganssod-1. (A) Ilustração esquemática representando a estrutura exon-intron do lócus sod-1 em C. elegans. A barra vermelha denota a localização do G93 no exon 3. O conjunto de pares de primer é notado pelas setas vermelhas (F1-R1). (B) Alinhamento sequenci…

Materials

Nuclease-free water	Synthego Inc.	provided with the sgRNA kit EZ kit
KCl	Sigma	P5405
DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo Research	D4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	New England Biolabs	M0494L
Proteinase K	Sigma	P2308
MgCl2	Sigma	M2393
NP-40	Sigma	74385
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
RNaseZap Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780