Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer<em> In Vivo</em
Summary
Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.
Abstract
Membraaneiwitten zijn essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen en zijn daarom belangrijke therapeutische doelen 1-3. Omdat ze functioneren in complexen 4, methoden om hun interacties te identificeren en karakteriseren nodig 5. Daarom hebben wij de membraan Strep-eiwitinteractie experiment genoemd Membraan-SPINE 6. Deze techniek combineert in vivo verknopen met de omkeerbare cross-linker formaldehyde met affiniteit zuivering van een Strep-gelabeld membraan aas eiwit. Tijdens de procedure, verknoopte prooi eiwitten co-gezuiverd met het membraan aas eiwit en vervolgens gescheiden door koken. Daarom kunnen twee grote taken worden uitgevoerd bij de analyse van eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten gebruik Membraan-STEKEL: ten eerste, de bevestiging van een voorgenomen interactiepartner door immunoblotting, en ten tweede, de identificatie van nieuwe interactie partners door massaspectrometrie-analyse . Bovendien, zelfs low affiniteit, voorbijgaande PPI's zijn detecteerbaar door deze techniek. Tot slot, Membraan-STEKEL is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel, waardoor het van toepassing als een krachtig screening tool om PPI's van membraaneiwitten te identificeren.
Introduction
Om de functie van een proteïne te begrijpen is het essentieel om de interactiepartners kennen. Verschillende klassieke technieken beschikbaar voor de identificatie van interactiepartners van oplosbare eiwitten. Echter, deze technieken niet gemakkelijk overdraagbaar eiwitten door hun hydrofobe aard 4 membraan. Om deze beperking te overwinnen, hebben we de Membraan Strep-eiwit interactie-experiment (Membraan-STEKEL) 6 ontwikkeld. Het is gebaseerd op de SPINE methode, die alleen voor oplosbare eiwitten 7.
Membraan-SPINE profiteert van twee voordelen van het verknopingsmiddel formaldehyde: eerste, formaldehyde gemakkelijk membranen binnendringen en genereert daardoor een nauwkeurige momentopname van de interactoom van een levende cel 8. Ten tweede, kan formaldehyde dwarsverbanden worden teruggedraaid door koken 9. Hier worden deze twee voordelen gebruikt om niet alleen vaste maar ook tijdelijke PPI membraan prote identificerenins 6.
In het kort wordt een Strep-tag gefuseerd met de C-terminus van de integrale membraan eiwitten aas. Cellen die het membraan aas eiwit geïncubeerd met formaldehyde crosslinks prooi eiwitten aan het membraan aas eiwit (Figuur 1). Wijzigingen van prooi eiwitten zijn niet nodig. Vervolgens wordt de membraan fractie bereid. Daarom zijn membraaneiwitten opgelost door detergensbehandeling en aas eiwitten co-gezuiverd met prooi eiwitten met affiniteitszuivering. Vervolgens wordt het verknopen omgekeerd door koken en het aas en de co-elueerde prooi eiwitten gescheiden door SDS-PAGE. Tenslotte kan prooi eiwitten worden geïdentificeerd door immunoblot analyse of massaspectrometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Membraan STEKEL analyse is een biochemische benadering die men in staat stelt om te bevestigen en om te identificeren om dit punt onbekende interactie partners van membraaneiwitten. Membraan STEKEL combineert in vivo verknoping door formaldehyde met zuivering van een Strep-gelabeld membraan aas eiwit. De combinatie met immunoblotting vergemakkelijkt de bevestiging van voorspelde interactiepartners (figuur 2). Bovendien, de combinatie met MS analyse maakt de identificatie van onbekende interacti…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 en SFB940 naar SH
Materials
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
Referencias
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat. Biotechnol. 25, (2007).
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
