קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה<em> בVivo</em
Summary
גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.
Abstract
החלבונים בממברנה הם חיוניים ליכולת קיום של תאים ולכן הם מטרות טיפוליות חשובות 1-3. מאז הם פועלים במתחמים 4, שיטות לזיהוי ואפיון של האינטראקציות שלהם נחוצות 5. לשם כך, פיתחנו ניסוי ממברנה סטרפטוקוקוס חלבון האינטראקציה, הנקרא ממברנה עמוד השדרה 6. טכניקה זו משלבת in vivo cross-linking באמצעות פורמלדהיד צולב מקשר הפיך עם טיהור זיקה של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. במהלך ההליך, חלבוני טרף צולבים הם שיתוף מטוהר עם חלבון פיתיון הקרום ולאחר מכן הופרד על ידי רתחה. לפיכך, ניתן לבצע שתי משימות עיקריות בעת ניתוח אינטראקציות בין חלבונים (-PPI) של חלבונים בממברנה באמצעות ממברנה בעמוד שדרה: ראשון, האישור של שותף אינטראקציה שהוצע על ידי immunoblotting, ושנית, זיהוי שותפי אינטראקציה חדשים על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה . יתר על כן, גם אניow זיקה, PPIs החולף הוא לגילוי על ידי טכניקה זו. לבסוף, ממברנה שדרה להתאמה כמעט לכל סוג תא, מה שהופך אותו מתאים ככלי מיון רבי עוצמה כדי לזהות-PPI של חלבונים בממברנה.
Introduction
כדי להבין את תפקידו של חלבון זה חיוני לדעת שותפי האינטראקציה שלה. כמה טכניקות קלאסיות זמינות לזיהוי שותפי אינטראקציה של חלבונים מסיסים. עם זאת, טכניקות אלה אינן ניתנות להעברה בקלות לחלבוני קרום בשל האופי ההידרופובי שלהם 4. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו ניסוי האינטראקציה סטרפטוקוקוס חלבון ממברנה (ממברנה-עמוד שדרה) 6. היא מבוססת על שיטת עמוד השדרה, שהייתה מתאים רק לחלבונים מסיסים 7.
יתרונות קרום עמוד שדרה משני יתרונות של פורמלדהיד סוכן cross-linking: ראשון, פורמלדהיד יכול לחדור בקלות ממברנות ולכן מייצר תמונת מצב מדויקת של interactome של תא חי 8. שנית, יכולים להיות הפוכים קישורים צולבים פורמלין על ידי הרתחת 9. הנה, שני יתרונות אלו משמשים לזיהוי לא רק-PPI קבוע, אלא גם הגנה של מחזור החולף של קרוםתוספות 6.
בקיצור, סטרפטוקוקוס תג הוא קבע את C-הסופית של חלבון פיתיון קרום נפרד. תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום מודגרת עם פורמלדהיד אשר חוצה קישורים לטרוף חלבונים לחלבון פיתיון קרום (איור 1). שינויים של חלבוני טרף אין צורך. בשלב הבא, את החלק יחסי הקרום מוכן. לכן, חלבוני קרום solubilized על ידי טיפול בחומרי ניקוי ופיתיון חלבונים הם שיתוף מטוהר עם חלבוני הטרף שלה באמצעות טיהור זיקה. בהמשך לכך, הקישור הצולב מתהפך על ידי רותחים, ואת הפיתיון והחלבונים טרף שיתוף eluted-מופרדים על ידי-SDS. לבסוף, ניתן לזהות חלבוני טרף על ידי ניתוח immunoblot או ספקטרומטריית מסה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח עמוד שדרת ממברנה הוא גישה ביוכימית, המאפשרת אחד כדי לאשר ולזהות לשותפי שלב זה לא ידוע אינטראקציה של חלבונים בממברנה. עמוד שדרת קרום משלבת in vivo cross-linking ידי פורמלדהיד עם טיהור של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. שילוב עם immunoblotting מאפשר האישור של שותפי אינ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 וSFB940 לSH
Materials
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
Referencias
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat. Biotechnol. 25, (2007).
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
