Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em> In Vivo</em

Summary

Eine biochemische Ansatz beschrieben, um die in vivo-Protein-Protein-Interaktionen (PPI) der Membranproteine ​​zu identifizieren. Das Verfahren kombiniert Proteinvernetzung, Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie, und ist an fast jedem Zelltyp oder Organismus. Mit diesem Ansatz wird auch die Identifizierung der transienten PPI möglich.

Abstract

Membranproteine ​​sind essentiell für die Lebensfähigkeit der Zellen und sind daher wichtige therapeutische Ziele ^3.1. Da sie in den Komplexen ⁴ funktionieren, sind Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung ihrer Wechselwirkungen notwendig ^5. Zu diesem Zweck haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment genannt Membran-Dorn ^6. Diese Technik kombiniert in vivo Vernetzen unter Verwendung des reversiblen Vernetzungsmittel Formaldehyd mit Affinitätsreinigung von Strep-tag eine Membran Köderprotein. Während des Verfahrens sind vernetzte Beuteproteine ​​mit der Membran Köderprotein co-gereinigt und anschließend durch Kochen getrennt. Daher können zwei wichtige Aufgaben bei der Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) von Membranproteinen mit Membran-Dorn ausgeführt werden: erstens die Bestätigung einer vorgeschlagenen Interaktionspartner durch Immunoblotting, und zweitens die Identifizierung neuer Interaktionspartner von Massenspektrometrie-Analyse . Außerdem, selbst low Affinität, sind vorübergehende PPI durch diese Technik nachweisbar. Schließlich ist Membran-SPINE anpassungsfähig an nahezu jeden Zelltyp, so dass es zutreffend als ein leistungsfähiges Werkzeug, um Screening PPI von Membranproteinen zu identifizieren.

Introduction

Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seinen Interaktionspartnern kennen. Mehreren klassischen Techniken zur Identifizierung von Interaktionspartnern von löslichen Proteinen zur Verfügung. Jedoch sind diese Techniken nicht ohne weiteres übertragbar, um Proteine ​​aufgrund ihrer hydrophoben Natur ⁴ Membran. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment (Membran-spine) ⁶ entwickelt. Es basiert auf der Methode DORN, die nur für lösliche Proteine ​​geeignet war ⁷ basiert.

Membran-SPINE profitiert von zwei Vorteile des Vernetzungsmittels Formaldehyd: erste Formaldehyd kann leicht durchdringen Membranen und erzeugt eine genaue Momentaufnahme der Interaktom einer lebenden Zelle ⁸ daher. Zweitens kann Formaldehyd vernetzt durch Kochen ⁹ umgekehrt werden. Hier werden diese beiden Vorteile verwendet, um nicht nur dauerhaft, sondern auch vorübergehende PPI Membran Prote identifizierenIns ^6.

Kurz gesagt, ein Strep-Tag an den C-Terminus des integralen Membranköderprotein fusioniert ist. Zellen, die den Membranköderprotein exprimieren, werden mit Formaldehyd vernetzt Beute-Proteine ​​an die Membran Köder-Protein (Fig. 1) inkubiert. Modifikationen der Beuteproteine ​​sind nicht erforderlich. Als nächstes wird die Membranfraktion bereit. Daher sind Membranproteine ​​durch Detergens-Behandlung und Köder-Proteine ​​sind mit ihrer Beute Proteinen unter Verwendung von Affinitätsreinigung gereinigt Zusammenarbeit gelöst. Anschließend wird die Vernetzung durch Kochen umgekehrt, und der Köder und deren koeluierte Beute-Proteine ​​werden durch SDS-PAGE getrennt. Schließlich kann Beuteproteine ​​durch Immunoblot-Analyse bzw. Massenspektroskopie identifiziert werden.

Protocol

Hinweis: Detaillierte Informationen zur Puffer im Protokoll angegeben ist in Tabelle 1 verfügbar. 1. Fixierung von Protein-Protein-Interaktionen durch Formaldehyd-Vernetzungs in lebenden Zellen Um zu beginnen vorzubereiten Wachstumsmedien, Stammlösungen und Puffer P1 Bereiten 500 ml Medium: Das Medium sollte Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen Membran Köderprotein und Beuteproteine ​​unterstützen. Darüber hinaus sollte ein Versuch unter …

Representative Results

Membran SPINE-Analyse erlaubt die Co-Reinigung von Membranproteinen und transient interacting protein Partnern. Die Co-Reinigung unter Verwendung der Vernetzungsmittel Formaldehyd erreicht. Zwei Parameter sind wichtig, um unspezifische Vernetzungen verhindern: die Formaldehyd-Konzentration und der Vernetzungszeit. Die ausreichende, aber nicht übermäßige Verwendung von Formaldehyd kann leicht durch Immunoblotting gesteuert werden. Formaldehyd vernetztem Protein-Komplexe durch Kochen aber nicht durch SDS-Behandlung abg…

Discussion

Membran SPINE Analyse ist ein biochemischer Ansatz, ermöglicht ein, um zu bestätigen und um zu diesem Punkt unbekannte Interaktionspartner von Membranproteinen zu identifizieren. Membran SPINE vereint in vivo Vernetzung durch Formaldehyd mit Reinigung eines Strep-markierten Membranköderprotein. Die Kombination mit Immunoblotting erleichtert den Nachweis von vorhergesagten Wechselwirkungspartner (Fig. 2). Zusätzlich wird die Verbindung mit MS-Analyse erlaubt die Identifikation unbekannter In…

Materials

37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge