Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı<em> In Vivo</em
Summary
Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.
Abstract
Zar proteinleri, hücre canlılığı için gerekli olan ve bu nedenle önemli bir terapötik hedef 1-3 bulunmaktadır. Bu kompleksler 4 işlev için, bunların etkileşimleri belirlemek ve karakterize etmek için yöntemler 5 gereklidir. Bu amaçla, biz Membran-OMURGA 6 denilen Membran Strep-protein etkileşim deney geliştirdi. Bu teknik, Strep-işaretli zar yem proteinin afinite saflaştırma ile geri dönüşümlü çapraz bağlayıcı formaldehit kullanılarak çapraz bağlama, in vivo olarak bir araya getirmektedir. İşlem sırasında, çapraz bağlanmış av proteinleri membran yem protein ile birlikte saf hale getirilir ve daha sonra kaynatılarak ayrılır. Membran omurga kullanılarak zar proteinlerinin protein-protein etkileşimleri (PPI) analiz Bu yüzden, iki ana görevleri icra edilebilir: ilk olarak, immün, tarafından önerilen bir etkileşim ortağının ikinci onay, kütle spektrometrisi analizi ile yeni etkileşim ortaklarının tespiti . Dahası, lafinite ow, geçici PPIs Bu teknik ile tespit edilebilir. Son olarak, Membran-OMURGA membran proteinlerinin PPI tanımlamak için güçlü bir tarama aracı olarak geçerli hale, hemen hemen herhangi bir hücre tipine uyarlanabilir.
Introduction
Bir proteinin işlevini anlamak için onun etkileşim ortaklarını bilmek önemlidir. Çeşitli klasik teknikler çözünür proteinlerin etkileşimi ortaklarının tespiti için kullanılabilir. Ancak, bu teknikler, hidrofobik doğası 4 dolayı zar proteinleri kolaylıkla transfer edilemez. Bu sınırlamayı aşmak için, Membran Strep-protein etkileşim deneyi (Membran-OMURGA) 6 geliştirdik. Bu çözünür proteinler 7 için uygundur olan OMURGA yöntemine dayanmaktadır.
Çapraz bağlama maddesi, iki formaldehid avantajlarından zara OMUR faydaları: ilk olarak, formaldehit kolayca nüfuz membranlar ve bu nedenle, bir canlı hücrenin 8'in interactome kesin bir görüntüsünü oluşturur olabilir. İkincisi, formaldehit çapraz bağlantılar 9 kaynatılarak ters olabilir. Burada, bu iki avantajı zar prote sürekli değil, aynı zamanda geçici bir PPI, sadece tanımlamak için kullanılırins 6.
Kısaca, Strep-eklentisi, integral zar yem proteinin C-ucuna kaynaştırılır. Membran yem proteini eksprese eden hücreler, çapraz bağlantıları membran proteinine yem proteinleri av formaldehid (Şekil 1) ile birlikte inkübe edilir. Av proteinleri modifikasyonları gerekli değildir. Daha sonra, membran fraksiyonu hazırlanır. Bu nedenle, membran proteinleri proteinleri afinite arıtma kullanarak av proteinleri ile birlikte saf hale deterjan tedavisi ve yem ile eritilir. Daha sonra, çapraz-link kaynatma ile tersine çevrilir ve yem ve eş-elüt av proteinler SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Son olarak, av proteinleri bağışıklık beneklenme analizi veya kütle spektroskopisi ile tespit edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Membran OMURGA analiz onaylamak ve membran proteinlerinin bu noktada bilinmeyen bir etkileşim ortakları tanımlamak için birini sağlayan biyokimyasal bir yaklaşımdır. Membran OMURGA bir Strep-etiketli yem zar proteini saflaştırılması ile formaldehid ile çapraz bağlanması vivo olarak bir araya getirmektedir. Immüno-lekeleme ile kombinasyon tahmin etkileşim ortaklarının onay (Şekil 2) kolaylaştırır. Buna ek olarak, MS analizi ile kombine bilinmeyen etkileşim ortaklarının …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma SH Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 ve SFB940 hibeler ile desteklenmiştir
Materials
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
Referencias
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat. Biotechnol. 25, (2007).
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
