Un enfoque bioquímico se describe para identificar in vivo interacciones proteína-proteína (PPI) de proteínas de membrana. El método combina la reticulación de proteínas, purificación por afinidad y espectrometría de masas, y es adaptable a casi cualquier tipo de célula u organismo. Con este enfoque, incluso la identificación de los IBP transitorios se hace posible.
Las proteínas de membrana son esenciales para la viabilidad celular y son, por tanto, importantes objetivos terapéuticos 1-3. Desde que funcionan en los complejos 4, los métodos para identificar y caracterizar sus interacciones son necesarias 5. Con este fin, hemos desarrollado el Strep-proteína de membrana experimento de interacción, denominada membrana-COLUMNA 6. Esta técnica combina en vivo entrecruzamiento reversible mediante el formaldehído reticulante con la purificación por afinidad de una proteína de membrana de cebo-Strep etiquetado. Durante el procedimiento, las proteínas presa reticulados son co-purificadas con la proteína cebo membrana y posteriormente separados por ebullición. Por lo tanto, dos grandes tareas se pueden ejecutar en el análisis de las interacciones proteína-proteína (PPI) de las proteínas de membrana mediante membrana-COLUMNA: en primer lugar, la confirmación de un compañero de interacción propuesto por inmunotransferencia, y en segundo lugar, la identificación de nuevos socios de la interacción mediante el análisis de espectrometría de masas . Además, incluso lOW afinidad, IBP transitorios son detectables por esta técnica. Por último, la Membrana-ESPINA es adaptable a casi cualquier tipo de célula, por lo que es aplicable como herramienta de detección de gran alcance para identificar los IBP de proteínas de membrana.
Para entender la función de una proteína que es esencial conocer sus compañeros de interacción. Varias técnicas clásicas están disponibles para la identificación de parejas de interacción de proteínas solubles. Sin embargo, estas técnicas no son fácilmente transferibles a proteínas de la membrana debido a su naturaleza hidrófoba 4. Para superar esta limitación, hemos desarrollado la membrana Strep-proteína interacción experimento (Membrana-COLUMNA) 6. Se basa en el método de columna vertebral, que era sólo es adecuado para proteínas solubles 7.
Beneficios de membrana-espina dorsal de dos ventajas de la formaldehído agente de reticulación: primero, el formaldehído pueden penetrar fácilmente las membranas y por lo tanto genera una instantánea precisa de la interactoma de una célula viva 8. En segundo lugar, formaldehído enlaces cruzados pueden revertirse mediante ebullición 9. Aquí, estas dos ventajas se utilizan para identificar no sólo los IBP permanentes pero también transitorios de prot membranains 6.
En breve, un Strep-etiqueta se fusiona al C-terminal de la proteína cebo integral de membrana. Las células que expresan la proteína cebo de membrana se incuban con formaldehído que los enlaces cruzados se aprovechan de las proteínas a la proteína cebo membrana (Figura 1). No son necesarias modificaciones de las proteínas de la presa. A continuación, la fracción de membrana se prepara. Por lo tanto, las proteínas de membrana se solubilizan por tratamiento con detergente y cebo proteínas son co-purificadas con sus proteínas presa utilizando la purificación por afinidad. Posteriormente, la reticulación se invierte por ebullición, y el cebo y sus proteínas presa co-eluidos se separan por SDS-PAGE. Finalmente, las proteínas presa pueden ser identificados por análisis de inmunotransferencia o espectrometría de masas.
Análisis COLUMNA membrana es un enfoque bioquímico que permite a uno para confirmar e identificar a este punto desconocidos compañeros de interacción de proteínas de membrana. COLUMNA membrana combina in vivo reticulación por formaldehído con la purificación de una proteína cebo membrana-Strep etiquetado. La combinación con inmunotransferencia facilita la confirmación de parejas de interacción predichas (Figura 2). Además, la combinación con el análisis de MS permite la identific…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 y SFB940 a SH
37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
DNaseI | Sigma | DN25 | |
BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
Ultracentrifuge |