Confocale beeldvorming van Single mitochondriaal superoxide Knippert Intact Heart of<em> In Vivo</em
Summary
Confocale scanning microscopie wordt toegepast voor beeldvorming enkele mitochondriale gebeurtenissen in doorbloed hart of skeletspieren in levende dieren. Real-time monitoring van enkele mitochondriale processen zoals superoxide flitsen en membraanpotentiaal schommelingen kan de evaluatie van de mitochondriale functie in een fysiologisch relevante context en tijdens pathologische verstoringen.
Abstract
Mitochondrion is een kritische intracellulaire organellen verantwoordelijk voor de productie van energie en intracellulaire signalering in eukaryote systemen. Mitochondriale dysfunctie vergezelt vaak en draagt bij menselijke ziekte. De meerderheid van de benaderingen die zijn ontwikkeld om mitochondriale functie en dysfunctie evalueren op basis van in vitro of ex vivo metingen. Resultaten van deze experimenten beperkt vermogen bepalen mitochondriale functie in vivo. Hier beschrijven we een nieuwe benadering die confocale scanning microscopie gebruikt voor de beeldvorming van intacte weefsels in levende aminals, die de evaluatie van een mitochondriale functie kan in een real-time wijze in vivo. Ten eerste, genereren we transgene muizen die het mitochondriale gerichte superoxide indicator, circulair gepermuteerde geel fluorescerend eiwit (mt-cpYFP). Verdoofde mt-cpYFP muis wordt op een op maat gemaakte stadium adapter en time-lapse beelden worden genomen fROM De blootgestelde skeletspieren van het achterbeen. De muis wordt vervolgens opgeofferd en het hart is ingesteld voor Langendorff perfusie met fysiologische oplossingen bij 37 ° C. De doorbloed hart is gepositioneerd in een speciale kamer op de confocale microscoop podium en zachte druk wordt uitgeoefend op het hart te immobiliseren en te onderdrukken hartslag veroorzaakte bewegingen artefact. Superoxide flitsen worden gedetecteerd door real-time 2D confocale beelden met een frequentie van een frame per seconde. De perfusie oplossing kan worden aangepast aan verschillende substraten ademhaling of andere fluorescente indicatoren bevatten. De perfusie kan ook worden aangepast aan ziektemodellen zoals ischemie en reperfusie produceren. Deze techniek is een unieke benadering voor het bepalen van de functie van enkele mitochondriën in intacte weefsels en in vivo.
Introduction
Mitochondriën spelen een centrale rol in de cel bio-energetica, vrije radicalen signalering, redox homeostase, ionenregulatie en cellot vastberadenheid 1,2. Mitochondriën dysfunctie vergezelt vaak en ten grondslag aan de pathogenese van ziekten 3-6. Vooral in de spier systemen zoals het hart en de skeletspieren, mitochondriale ademhaling levert de meeste ATP tijdig regulatie van intracellulair calcium en robuuste krachtontwikkeling 7,8 ondersteunen. Deze spieren hebben een groot aantal mitochondria die vaak innemen tot 20-40% van het totale celvolume en worden "vaste" tussen myofilamenten 2.
Ondanks talrijke studies, ons begrip van de mitochondriale functie, met name bedoeld in vivo en onder fysiologisch relevante omstandigheden, is beperkt. Een van de redenen is dat de meerderheid van de ontwikkeld voor evaluatie mitochondriale werkwijzen vertrouwen in Vitro of ex vivo technieken, zoals het toezicht het zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondria aangevuld met kunstmatige substraten en de indirecte bepaling van de mitochondriale functie door morfologie (bv. elektronenmicroscopie), enzymactiviteit (zoals aconitase activiteit) of intracellulaire ATP 9-11 .
Onlangs hebben kleine molecule fluorescente indicatoren relatieve mitochondriaal verrijking toegepast op een blik van de mitochondriale signalen, waaronder membraanpotentiaal, calcium en reactieve zuurstof species (ROS), in intacte cellen 11-13 verschaffen. Bovendien hebben diverse groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerd redox en ROS indicatoren ontwikkeld om meer specifieke evaluatie van de gecompartimenteerde intracellulaire redox of ROS aangeeft 14-16 bereiken. Onder deze, ontwikkelden we een genetisch gecodeerd superoxide indicator, de cirkelvormige gepermuteerde geel fluorescerend eiwit, en targeted het in de mitochondriën (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP kan worden opgewekt bij 405 of 488 nm met beide emissie pieken op 515 nm. De emissie bij 488 nm excitatie specifiek reageert superoxide zoals door eerdere in vitro es in vivo kalibraties 17,18. De emissie bij 405 nm excitatie wordt gebruikt als interne controle (zie figuur 1 van Ref 17 voor gedetailleerde informatie over de emissie en excitatie spectra van mt-cpYFP onder verschillende omstandigheden). Met time-lapse confocale imaging, detecteert deze indicator barsten superoxide productie gebeurtenissen, genoemd superoxide flitsen, in enkele mitochondriën van intacte cellen. Superoxide flitser dient als een samengestelde functie van mitochondriale ademhaling, begeleidende voorbijgaande mitochondriale membraandepolarisatie en ROS productie 17-20. Onlangs hebben we de pan-weefsel mt-cpYFP transgene muizen met behulp van de pUC-CAGGS-mt-cpYFP vector 17,19 op C57/BL6 achtergrond gegenereerd en gecontroleerd de sterke expresning van deze indicator in het hart, de skeletspieren en andere weefsels (figuur 2). De transgene muizen zal beschikbaar zijn voor geïnteresseerde academische onderzoekers zijn op aanvraag en MTA goedkeuring door de Universiteit van Washington.
In deze studie beschrijven we in situ beeldvorming van superoxide knippert in Langendorff doorbloed hart als in vivo beeldvorming van flash gebeurtenissen in skeletspieren van verdoofde mt-cpYFP transgene muizen 17,19. Deze technologie maakt real-time monitoring van enkele mitochondriale ROS productie gebeurtenissen in een fysiologisch relevante voorwaarde of in vivo 21,22. Het is ook mogelijk om het systeem te gebruiken om andere afzonderlijke parameters zoals mitochondriale membraanpotentiaal en calcium met geschikte fluorescente indicatoren controleert. Verder, gelijktijdig en parallel evaluatie van de mitochondriale functie met intracellulaire gebeurtenissen (bijvoorbeeld calcium transiënten) of hartfunctie (bijv.. Ejectiefractie) worden bereikt. Pathologische storingen, zoals ischemie en reperfusie, kunnen worden toegepast op geperfundeerde hart om het effect van stress op enkele mitochondriale functie in de intacte myocardium beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beeldvorming enkele mitochondriale gebeurtenissen in levende dieren of perfusie organen heeft belangrijk voordeel ten opzichte van traditionele methoden voor de mitochondriale functie evaluatie 17,19,21,22,24,25. De hier beschreven techniek kan real-time te bereiken in situ bepaling van de mitochondriale functie in een echte fysiologische toestand op de subcellulaire resolutie. Dit is bijzonder nuttig in combinatie met andere metingen, systemisch analyse van de rol van mitochondriën in de normale fu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Drs bedanken. Heping Cheng, Huiliang Zhang en Stephen Kolwicz voor hun waardevolle commentaar en technische ondersteuning bij de ontwikkeling van deze methode. Deze studie werd ondersteund door NIH subsidies en de Scientist Development Grant van American Heart Association om WW.
Materials
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. |
Referencias
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. . Mitochondria. , (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
- Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
