ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em> בVivo</em
Summary
מיקרוסקופיה confocal הסריקה מיושמת הדמיה אירועי המיטוכונדריה בודדות בלב perfused או שרירי שלד בבעלי חיים בשידור חי. ניטור של תהליכי המיטוכונדריה יחיד כגון הבזקי סופראוקסיד ותנודות פוטנציאל הממברנה בזמן אמת מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ובמהלך ההפרעות פתולוגיות.
Abstract
Mitochondrion הוא אברון תאיים קריטי אחראי על ייצור אנרגיה ואיתות תאית במערכות אוקריוטים. תפקוד המיטוכונדריה לעתים קרובות מלווה ותורם למחלות בבני אדם. רוב הגישות שפותחו כדי להעריך את התפקוד ותפקוד המיטוכונדריה מבוססים על במבחנה או מדידות vivo לשעבר. יש תוצאות מניסויים אלה בקביעת יכולת תפקוד המיטוכונדריה in vivo מוגבלות. כאן, אנו מתארים גישה חדשנית אשר מנצלת מיקרוסקופיה confocal סריקה עבור ההדמיה של רקמות שלמות בaminals החי, המאפשרת ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה אחת באופן בזמן אמת בגוף חי. ראשית, עלינו ליצור עכברים מהונדסים המבטאים את מחוון סופראוקסיד המיטוכונדריה הממוקד, חלבון permuted מעגלית צהוב ניאון (MT-cpYFP). MT-cpYFP הרדים עכבר קבוע במתאם שלב מחוייט וזמן לשגות תמונות נלקחות from שרירי שלד החשוף של hindlimb. העכבר הקריב לאחר מכן והלב מוגדר לזלוף Langendorff עם פתרונות פיסיולוגיים ב 37 ° C. לב perfused ממוקם בתא מיוחד על הבמה מיקרוסקופ confocal ולחץ עדין מוחל כדי לשתק את הלב ולדכא את פעימות לב חפץ בתנועה מושרה. הבזקי סופראוקסיד מזוהים על ידי ההדמיה confocal 2D בזמן אמת בתדר של מסגרת אחת לשנייה. פתרון זלוף יכול להיות שונה כדי להכיל את מצעי נשימה שונים או אינדיקטורים ניאון אחרים. זלוף גם יכול להיות מותאם כדי לייצר מודלים מחלה כגון איסכמיה ו reperfusion. טכניקה זו היא גישה ייחודית לקביעת הפונקציה של המיטוכונדריה בודדת ברקמות שלמות וin vivo.
Introduction
מיטוכונדריה לשחק תפקיד מרכזי בbioenergetics תא, איתות של רדיקלים חופשיים, הומאוסטזיס חיזור, רגולציה יון, ו1,2 קביעת גורל תא. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ולעתים קרובות מלווה ביסוד פתוגנזה של מחלות 3-6. במיוחד במערכות השרירים כגון לב ושרירי שלד, נשימה המיטוכונדריאלי מספקת את הרוב של ה-ATP לתמיכה ברגולציה בזמן של סידן תוך תאי ו7,8 פיתוח כוח חזק. שרירים אלה יש מספר גדול של מיטוכונדריה כי לעתים קרובות לכבוש עד 20-40% מכלל נפח התא והם "קבועים" בין myofilaments 2.
למרות מחקרים רבים, ההבנה של הרגולציה התפקוד המיטוכונדריה, במיוחד in vivo ובתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שלנו, מוגבלת. אחת הסיבות הוא כי רוב השיטות שפותחו להערכת תפקוד המיטוכונדריה להסתמך על בvitro או vivo לשעבר גישות, כגון ניטור צריכת החמצן של מיטוכונדריה המבודדת בתוספת מצעים מלאכותיים, והקביעה העקיפה של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות מורפולוגיה (מיקרוסקופיה למשל אלקטרון), פעילות האנזים (פעילות aconitase למשל), או רמות ה-ATP תאית 9-11 .
לאחרונה, אינדיקטורים ניאון מולקולה קטנים עם העשרת המיטוכונדריה היחסית יושמו כדי לספק הצצה אותות המיטוכונדריה, כוללים פוטנציאל ממברנה, סידן ומיני חמצן תגובתי (ROS), בתאים שלמים 11-13. יתר על כן, כמה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) חיזור מבוסס ואינדיקטורים ROS פותחו כדי להשיג הערכה ספציפית יותר של חיזור תאיים הממודר או ROS מאותת 14-16. בקרב זה, פיתחנו אינדיקטור מקודד גנטי סופראוקסיד, חלבון פלואורסצנטי הצהוב permuted המעגלי, וtargeteד אותו למיטוכונדריה (MT-cpYFP) 17. יכול להיות נרגש MT-cpYFP ב405 או 488 ננומטר עם שתי פסגות הפליטה ב 515 ננומטר. הפליטה ב 488 עירור ננומטר היא דווקא מגיבה לסופראוקסיד כפי שמוצג על ידי קודם במבחנה בכיולי vivo 17,18. הפליטה ב 405 עירור ננומטר משמשת כבקרה פנימית (עיין באיור 1 של Ref 17 למידע מפורט על ספקטרום הפליטה ועירור של MT-cpYFP בתנאים שונים). עם confocal הדמיה הזמן לשגות, אינדיקטור זה מזהה מתפוצץ אירועי סופראוקסיד ייצור, בשם הבזקי סופראוקסיד, במיטוכונדריה בודדת של תאים שלמים. הבזק סופראוקסיד משמש כפונקציה משולבת של נשימה המיטוכונדריאלי, שלילת קוטביות קרום נלווית חולפת המיטוכונדריה וייצור ROS 17-20. לאחרונה, יש לנו שנוצרו העכברים הטרנסגניים MT-cpYFP הפאן רקמות באמצעות וקטור PUC-CAGGS-MT-cpYFP 17,19 על רקע C57/BL6 ואימתו את הביטויים חזקיםשיאון של אינדיקטור זה בלב, שרירי שלד ורקמות אחרות (איור 2). העכברים מהונדסים יהיו זמינים לחוקרים אקדמיים מעוניינים על פי דרישה וMTA אישור על ידי אוניברסיטת וושינגטון.
במחקר זה, אנו מתארים בהדמיה באתרו של הבזקי סופראוקסיד בלב perfused Langendorff כמו גם in vivo הדמיה של אירועי הבזק שברירי שלד של עכברים הטרנסגניים הרדים MT-cpYFP 17,19. טכנולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועי ייצור ROS המיטוכונדריה אחד במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית או in vivo 21,22 זמן אמת. זה גם אפשרי על מנת להשתמש במערכת לניטור פרמטרים המיטוכונדריה אחת אחרים כגון פוטנציאל קרום וסידן עם אינדיקטורים ניאון מתאימים. הערכה נוספת, בו זמנית או במקביל של תפקוד המיטוכונדריה עם אירועים תאיים (למשל ארעיים סידן) או את תפקוד לב (לדוגמא:. פליטת חלקיק) יכול להיות מושגת. הפרעות פתולוגיות, כגון איסכמיה ו reperfusion, יכולות להיות מיושמות על לב perfused כדי להעריך את ההשפעה של מתח על תפקוד המיטוכונדריה בודד בשריר הלב ללא פגע.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש הדמיה אירועי המיטוכונדריה אחת בחי או באיברי perfused יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות ל17,19,21,22,24,25 הערכת תפקוד המיטוכונדריה. הטכניקה המתוארת כאן יכולה להשיג בזמן אמת בנחישות באתרו של תפקוד המיטוכונדריה במצב פיסיולוגי אמיתי ברזולוציה subcellular. התכונה זו שי?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לבני זוג. הפינג נג, Huiliang ז'אנג וסטיבן Kolwicz על הערותיהם מועילות ותמיכה טכנית בפיתוח בשיטה זו. מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH ומדען הפיתוח גרנט מאיגוד לב האמריקאי למלחמת העולם.
Materials
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. |
Referencias
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. . Mitochondria. , (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
- Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
