Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или<em> В Vivo</em
Summary
Конфокальной сканирующей микроскопии применяется для работы с изображениями одиночных митохондриальные события в перфузии сердца или скелетных мышц в живого животного. Мониторинг в реальном времени отдельных митохондриальных процессов, таких как супероксид вспышек и мембранных возможных колебаний позволяет оценку функции митохондрий в физиологически соответствующем контексте и при патологических возмущений.
Abstract
Митохондрия является одним из важнейших внутриклеточных органелл отвечает за производство энергии и внутриклеточной сигнализации в эукариотических системах. Митохондриальная дисфункция часто сопровождает и способствует болезни человека. Большинство из подходов, которые были разработаны для оценки функции митохондрий и дисфункции основаны на в пробирке или бывших естественных условиях измерений. Результаты этих экспериментов имеют ограниченные возможности в определении функции митохондрий в естественных условиях. Здесь мы описываем новый подход, который использует конфокальной сканирующей микроскопии для визуализации здоровых тканей в живых Aminals, что позволяет оценить одной функции митохондрий в режиме реального времени образом в естественных условиях. Во-первых, мы создаем трансгенных мышей, экспрессирующих митохондриальную целевой показатель супероксид, циркулярно переставленную желтый флуоресцентный белок (т-cpYFP). Наркозом т-cpYFP мыши фиксируется на заказ адаптера стадии и покадровой изображения взяты ером открытые скелетные мышцы задних конечностей. Мышь впоследствии пожертвовал и сердце настроен на Лангендорфа перфузии с физиологическими решений при 37 ° С Перфузии сердца позиционируется в специальной камере на конфокальной столик микроскопа и нежный давление применяется для иммобилизации сердце и подавлять сердцебиение индуцированной артефакт движения. Супероксидного вспышки обнаруживаются в реальном времени 2D конфокальной микроскопии на частоте одного кадра в секунду. Решение перфузии можно модифицировать, чтобы содержать различные субстраты дыхания или других флуоресцентных индикаторов. Перфузии также может быть скорректирована, чтобы произвести модели заболеваний, таких как ишемии и реперфузии. Эта техника является уникальный подход для определения функции одной митохондрии в здоровых тканей и в естественных условиях.
Introduction
Митохондрии играют центральную роль в клеточных биоэнергетики, бесплатный сигнализации радикал, окислительно-восстановительного гомеостаза, регулирование ионного и клеточных судеб определения 1,2. Митохондрии дисфункция часто сопровождает и лежит в основе патогенеза заболеваний 3-6. Особенно в системах мышц, таких как сердце и скелетных мышц, дыхание митохондрий обеспечивает большую часть АТФ, чтобы поддержать своевременное регулирование внутриклеточного кальция и надежный 7,8 развития силы. Эти мышцы обладают большое количество митохондрий, которые часто занимают до 20-40% от общего объема клеток и "фиксированных" между миофиламентов 2.
Несмотря на многочисленные исследования, наше понимание регуляции митохондриальной функции, в частности, в естественных условиях и под физиологически соответствующих условиях, ограничен. Одной из причин является то, что большинство методов, разработанных для оценки функции митохондрий положиться в ВИТРо или Экс Vivo подходы, такие как мониторинг потребления кислорода изолированными митохондриями с добавлением искусственных субстратах, а также косвенное определение митохондриальной функции через морфологии (например, электронной микроскопии), активность фермента (например аконитаза деятельность), или внутриклеточные АТФ уровни 9-11 .
В последнее время низкомолекулярные люминесцентные индикаторы с относительной митохондриальной обогащения были применены, чтобы обеспечить представление о митохондриальных сигналов, в том числе мембранного потенциала, кальция и активных форм кислорода (АФК), в неповрежденных клеток 11-13. Кроме того, некоторые зеленый флуоресцентный белок (GFP) на основе окислительно-восстановительного потенциала и показатели ROS были разработаны для достижения более конкретную оценку на секции внутриклеточного редокс или ROS сигналов 14-16. Среди этого, мы разработали генетически закодированного индикатор супероксид, круговой переставляются желтый флуоресцентный белок, и targeteг он в митохондрии (мт-cpYFP) 17. м-cpYFP могут возбуждаться при 405 или 488 нм с обоих пиков выбросов на 515 нм. Излучение при возбуждении 488 нм именно реагировать на супероксид, на основании предыдущих в пробирке и в естественных калибровок 17,18. Излучение при возбуждении 405 нм используется в качестве внутреннего контроля (см. Рисунок 1 из Реф 17 для подробной информации о выбросах и возбуждения спектров MT-cpYFP в различных условиях). С конфокальной микроскопии покадровой, этот показатель обнаруживает разрыва производственных события супероксид, названные супероксид мигает, в отдельных митохондриях интактных клеток. Супероксид флэш служит сложной функции митохондрий дыхания, сопровождающего переходного митохондриальной деполяризации мембраны и продукции АФК 17-20. В последнее время мы сгенерировали пан-ткани т-cpYFP трансгенных мышей, используя вектор PUC-CAGGS-т-cpYFP 17,19 на C57/BL6 фоне и проверены сильные выраобсуждение этого показателя в сердце, скелетных мышцах и других тканях (рис. 2). Трансгенных мышей будут доступны для заинтересованных академических исследователей по запросу и утверждения MTA по Университете Вашингтона.
В этом исследовании мы описываем на месте изображений супероксидных вспышек в Лангендорфа перфузии сердца, а также в естественных изображений флэш событий в скелетных мышцах наркозом т-cpYFP трансгенных мышей 17,19. Эта технология позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени отдельных митохондриальных производственных РОС событий в физиологически соответствующего условия или в естественных условиях 21,22. Возможно также использовать систему для мониторинга других одиночных митохондриальные такие параметры, как мембранного потенциала и кальция с соответствующими люминесцентных индикаторов. Кроме того, одновременно или параллельно оценка функции митохондрий с внутриклеточных событий (например, переходных кальция) или функции сердца (например,. Фракция выброса) может быть достигнута. Патологические возмущения, такие как ишемии и реперфузии, могут быть применены к перфузии сердца, чтобы оценить воздействие стресса на одной митохондриальной функции в интактном миокарде.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуализация одиночных митохондриальные события в живого животного или перфузированных органов имеет существенное преимущество по сравнению с традиционными методами митохондриальной 17,19,21,22,24,25 оценки функции. Техника, описанная здесь можно добиться реального времени в о…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Хэпин Ченг, Huiliang Чжан и Стивен Kolwicz за их полезные комментарии и техническую поддержку в разработке этого метода. Работа выполнена при поддержке грантов НИЗ и ученый развития Грант от Американской ассоциации сердца к WW.
Materials
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. |
Referencias
- Brookes, P. S., Yoon, Y., Robotham, J. L., Anders, M. W., Calcium Sheu, S. S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 817-833 (2004).
- Scheffler, I. E. . Mitochondria. , (2008).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondria in heart failure. Cardiovasc. Res. 88, 40-50 (2010).
- Griffiths, E. J. Mitochondria and heart disease. Adv. Exp. Med. Biol. 942, 249-267 (2012).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).
- Pieczenik, S. R., Neustadt, J. Mitochondrial dysfunction and molecular pathways of disease. Exp. Mol. Pathol. 83, 84-92 (2007).
- Szentesi, P., Zaremba, R., van Mechelen, W., Stienen, G. J. M. ATP utilization for calcium uptake and force production in different types of human skeletal muscle fibres. J. Physiol. 531, 393-403 (2001).
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J. Bioenerg. Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem. 217, 409-427 (1955).
- Lambert, A. J., Brand, M. D. Reactive oxygen species production by mitochondria. Methods Mol Biol. 554, 165-181 (2009).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15038-15043 (2006).
- Dickinson, B. C., Srikun, D., Chang, C. J. Mitochondrial-targeted fluorescent probes for reactive oxygen species. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 50-56 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, 13044-13053 (2004).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wang, W., et al. Superoxide Flashes in Single Mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Wei-Lapierre, L., et al. Respective Contribution of Mitochondrial Superoxide and pH to Mitochondria-targeted Circularly Permuted Yellow Fluorescent Protein (mt-cpYFP) Flash Activity. J. Biol. Chem. 288, 10567-10577 (2013).
- Fang, H., et al. Imaging superoxide flash and metabolism-coupled mitochondrial permeability transition in living animals. Cell Res. 21, 1295-1304 (2011).
- Wei, L., et al. Mitochondrial superoxide flashes: metabolic biomarkers of skeletal muscle activity and disease. FASEB J. 25, 3068-3078 (2011).
- Sheu, S. S., Wang, W., Cheng, H., Dirksen, R. T. Superoxide flashes: illuminating new insights into cardiac ischemia/reperfusion injury. Future Cardiol. 4, 551-554 (2008).
- Wei, L., Dirksen, R. T. Perspectives on: SGP symposium on mitochondrial physiology and medicine: mitochondrial superoxide flashes: from discovery to new controversies. J. Gen. Physiol. 139, 425-434 (2012).
- Johnson, I., Spence, M. T. Z. Ch. 12.2. The Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 510-511 (2013).
- Wang, X., et al. Superoxide flashes: elemental events of mitochondrial ROS signaling in the heart. J. Mol. Cell Cardiol. 52, 940-948 (2012).
- Li, K., et al. Superoxide flashes reveal novel properties of mitochondrial reactive oxygen species excitability in cardiomyocytes. Biophys. J. 102, 1011-1021 (2012).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
- Pasdois, P., et al. Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers. Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).
- Granville, D. J., et al. Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1321-1326 (2004).
- Davidson, S. M., Yellon, D. M., Murphy, M. P., Duchen, M. R. Slow calcium waves and redox changes precede mitochondrial permeability transition pore opening in the intact heart during hypoxia and reoxygenation. Cardiovasc. Res. 93, 445-453 (2012).
