Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o<em> In Vivo</em
Summary
La microscopia confocale a scansione viene applicato per l'imaging eventi mitocondriali singoli in cuore perfuso o muscoli scheletrici in animale vivo. Monitoraggio in tempo reale dei processi mitocondriali singoli, come vampate di superossido e di membrana potenziali fluttuazioni consente la valutazione della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevanti e durante le perturbazioni patologiche.
Abstract
Mitocondrio è un organello intracellulare critico responsabile per la produzione di energia e di segnalazione intracellulare nei sistemi eucarioti. Disfunzione mitocondriale spesso accompagna e contribuisce alla malattia umana. La maggior parte dei metodi che sono stati sviluppati per valutare la funzione mitocondriale e la disfunzione si basano su in vitro o ex vivo misurazioni. I risultati di questi esperimenti hanno limitato la capacità di determinare la funzione mitocondriale in vivo. Qui, descriviamo un nuovo approccio che utilizza la microscopia confocale a scansione per l'imaging di tessuti intatti in aminals vivi, che permette di valutare singola funzione mitocondriale in maniera tempo reale in vivo. In primo luogo, generiamo topi transgenici che esprimono la mitocondriale mirato indicatore superossido, proteina fluorescente giallo circolarmente permutato (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestetizzato mouse è fissato su una scheda palcoscenico su misura e time-lapse immagini sono prese fRom muscoli scheletrici esposte del arti posteriori. Il mouse viene successivamente sacrificato e il cuore è impostato per Langendorff perfusione con soluzione fisiologica a 37 ° C. Il cuore perfuso è posizionato in una camera speciale sul palco microscopio confocale e leggera pressione viene applicata per immobilizzare il cuore e sopprimere battito cardiaco indotto artefatti da movimento. Superossido lampi vengono rilevati mediante real-time confocale 2D immagini ad una frequenza di un fotogramma al secondo. La soluzione di perfusione può essere modificata per contenere diversi substrati respiratori o altri indicatori fluorescenti. La perfusione può anche essere regolata per produrre modelli di malattie come l'ischemia e riperfusione. Questa tecnica è un approccio unico per la determinazione della funzione di singolo mitocondrio in tessuti normali e in vivo.
Introduction
I mitocondri svolgono un ruolo centrale nella bioenergetica di cellule, di segnalazione dei radicali liberi, redox omeostasi, regolazione ione, e il destino delle cellule determinazione 1,2. La disfunzione dei mitocondri spesso accompagna e sottende la patogenesi delle malattie 3-6. Soprattutto nei sistemi muscolari come il cuore e nei muscoli scheletrici, respirazione mitocondriale fornisce la maggior parte di ATP per sostenere regolamentazione tempestiva di calcio intracellulare e robusto 7,8 sviluppo della forza. Questi muscoli in possesso di un gran numero di mitocondri, che spesso occupano fino al 20-40% del volume cellulare totale e sono "corretti" tra miofilamenti 2.
Nonostante i numerosi studi, la nostra comprensione della regolazione della funzione mitocondriale, in particolare in vivo e in condizioni fisiologicamente rilevanti, è limitata. Uno dei motivi è che la maggior parte dei metodi sviluppati per valutare la funzione mitocondriale contare su di Vitroo approcci ex vivo, quali il monitoraggio del consumo di ossigeno di mitocondri isolati, completata con substrati artificiali, e la determinazione indiretta della funzionalità mitocondriale mediante la morfologia (ad esempio microscopia elettronica), l'attività enzimatica (ad esempio attività aconitasi), o livelli di ATP intracellulari 9-11 .
Recentemente, piccoli indicatori fluorescenti molecola con relativa arricchimento mitocondriale sono stati applicati per fornire un assaggio dei segnali mitocondriali, tra cui il potenziale di membrana, di calcio e di specie reattive dell'ossigeno (ROS), in cellule intatte 11-13. Inoltre, vari proteina fluorescente verde (GFP) basato redox e ROS indicatori sono stati sviluppati per ottenere una valutazione più specifica del redox intracellulare compartimenti o segnali ROS 14-16. Tra questo, abbiamo sviluppato un indicatore geneticamente codificato superossido, la proteina fluorescente gialla permutato circolare, e targeted in mitocondri (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP può essere eccitato a 405 o 488 nm con entrambi i picchi di emissione a 515 nm. L'emissione a 488 nm di eccitazione è specificamente rispondenti a superossido come mostrato dalla precedente in vitro e in vivo calibrazioni 17,18. L'emissione a 405 nm di eccitazione viene utilizzato come controllo interno (si veda la Figura 1 di Ref 17 per informazioni dettagliate sulle emissioni di eccitazione e spettri di mt-cpYFP in varie condizioni). Con il time-lapse imaging confocale, questo indicatore rileva scoppio eventi di produzione di superossido, chiamato superossido lampi, in singoli mitocondri delle cellule intatte. Superossido in flash serve come una funzione composta di respirazione mitocondriale, accompagnamento transitoria depolarizzazione della membrana mitocondriale e la produzione di ROS 17-20. Recentemente, abbiamo generato i pan-tessuto mt-cpYFP topi transgenici con il vettore pUC-CAGGS-mt-cpYFP 17,19 su C57/BL6 sfondo e verificato le forti espressionisione di questo indicatore nel cuore, muscoli scheletrici e altri tessuti (Figura 2). I topi transgenici sarà disponibile per ricercatori accademici interessati su richiesta e approvazione MTA dall'Università di Washington.
In questo studio, descriviamo in situ imaging lampeggia superossido in Langendorff cuore perfuso e immagini in vivo di eventi flash nella muscoli scheletrici di anestetizzati mt-cpYFP topi transgenici 17,19. Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale dei singoli eventi mitocondriali di produzione di ROS in una condizione fisiologicamente rilevanti o in vivo 21,22. È anche possibile utilizzare il sistema per monitorare altri parametri singoli mitocondriali come potenziale di membrana e calcio con indicatori fluorescenti appropriati. Valutazione ulteriore, simultanea o parallela della funzione mitocondriale con eventi intracellulari (ad esempio transienti di calcio) o funzione cardiaca (ad esempio. Frazione di eiezione) può essere raggiunto. Perturbazioni patologiche, quali ischemia e riperfusione, possono essere applicati al cuore perfuso per valutare l'impatto dello stress sulla singola funzione mitocondriale nel miocardio intatta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Imaging eventi mitocondriali singoli organi irrorati di animali vivi o ha un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali di valutazione della funzione mitocondriale 17,19,21,22,24,25. La tecnica qui descritta può realizzare in tempo reale in situ determinazione della funzionalità mitocondriale in una condizione fisiologica reale alla risoluzione subcellulare. Ciò è particolarmente utile, quando combinato con altre misurazioni, per studiare sistematicamente il ruolo dei mitocondri nel …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Drs. Heping Cheng, Huiliang Zhang e Stephen Kolwicz per i loro utili commenti e supporto tecnico nello sviluppo di questo metodo. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH e la Scientist Development Grant dalla American Heart Association a WW.
Materials
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. |
Referencias
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