Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em> In Vivo</em

Summary

Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.

Abstract

Mitochondrium ist ein wichtiger intrazellulären Organellen für die Energieproduktion und intrazelluläre Signal in eukaryontischen Systemen verantwortlich. Mitochondriale Dysfunktion oft begleitet und trägt zur menschlichen Krankheit. Mehrzahl der Ansätze, die entwickelt wurden, um die mitochondriale Funktion und Dysfunktion beurteilen sich auf in vitro oder ex vivo-Messungen. Ergebnisse aus diesen Versuchen sind die Fähigkeit zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion in vivo begrenzt. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, die konfokale Scanning-Mikroskopie für die Abbildung von intakten Geweben im Live Aminalen, die die Bewertung der einzelnen Funktion der Mitochondrien in einer Echtzeitweise in vivo ermöglicht nutzt. Zunächst erzeugen wir transgene Mäuse, die mitochondriale gezielte Superoxid-Indikator, zirkular permutiert gelb fluoreszierende Protein (mt-cpYFP) ausdrückt. Betäubt mt-cpYFP Maus auf eine maßgeschneiderte Tischadapter und Zeitraffer-Bilder werden f genommen Festrom die freiliegenden Skelettmuskeln der hinteren Gliedmaßen. Die Maus wird anschließend getötet und das Herz wird für Langendorff-Perfusion mit physiologischen Lösungen bei 37 ° C eingestellt Perfundierten Herzen in einer speziellen Kammer auf der konfokalen Mikroskoptisch positioniert und leichtem Druck aufgebracht wird, um das Herz zu immobilisieren und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte zu unterdrücken. Superoxid Wallungen werden durch Echtzeit-2D-konfokale Bildgebung bei einer Frequenz von einem Bild pro Sekunde erfasst. Die Perfusionslösung können modifiziert werden, um verschiedene Substrate Atmung oder andere Fluoreszenzindikatoren enthalten. Die Perfusion kann auch eingestellt werden, um Krankheitsmodellen wie Ischämie und Reperfusion zu erzeugen. Diese Technik ist ein einzigartiger Ansatz zur Bestimmung der Funktion von Einzel Mitochondrium in intakten Geweben und in vivo.

Introduction

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Zell Bioenergetik, Radikal Signalisierung, Redox-Homöostase, Ionenregulation und Zellschicksal Bestimmung ^1,2. Mitochondrien Dysfunktion oft begleitet und die Voraussetzung für die Entstehung von Krankheiten ^6.3. Insbesondere in den Muskelsysteme wie Herz-und Skelettmuskulatur liefert mitochondrialen Atmung der meisten ATP rechtzeitige Regulierung der intrazellulären Calcium und robuste Kraftentwicklung ^7,8 unterstützen. Diese Muskeln besitzen eine große Anzahl von Mitochondrien, die oft besetzen bis 20-40% des gesamten Zellvolumens und "fixiert" zwischen Myofilamenten ^2.

Trotz der zahlreichen Studien, das Verständnis der Regulation der mitochondrialen Funktion, insbesondere in vivo und unter physiologisch relevanten Bedingungen, begrenzt. Einer der Gründe ist, dass die Mehrheit der zur Auswertung der mitochondrialen Funktion entwickelten Methoden beruhen auf in vitro-oder ex vivo-Ansätze, wie die Überwachung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien mit künstlichen Substraten ergänzt, und die indirekte Bestimmung der mitochondrialen Funktion durch Morphologie (z. B. Elektronenmikroskopie), Enzymaktivität (z. B. Aconitaseaktivität) oder intrazellulären ATP-Spiegel ^9-11 .

Kürzlich, kleines Molekül Fluoreszenzindikatoren mit relativer mitochondrialen Bereicherung wurden angewendet, um einen Einblick in die mitochondriale Signale, einschließlich Membranpotential, Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), in intakten Zellen ^11-13 bieten. Außerdem haben mehrere grün fluoreszierende Protein (GFP) und ROS basierten Redox-Indikatoren entwickelt worden, um genauere Beurteilung des Fachintrazellulären Redox-oder ROS Signale ^14-16 zu erreichen. Unter diesem, eine genetisch kodierte Superoxid-Indikator, der Kreis permutierter gelb fluoreszierendes Protein und Targete entwickelten wird in Mitochondrien (mt-cpYFP) ^17. mt-cpYFP kann bei 405 oder 488 nm mit beiden Emissionspeaks bei 515 nm angeregt werden. Die Emission bei 488 nm Anregung, die auf Superoxid-spezifisch, wie durch vorherige in vitro-und in-vivo-Kalibrierung ^17,18 dargestellt. Die Emission bei 405 nm Anregung wird als interne Kontrolle verwendet (siehe hierzu detaillierte Informationen über die Emissions-und Anregungsspektren von mt-cpYFP unter verschiedenen Bedingungen Abbildung 1 von Lit. 17). Mit Zeitraffer-konfokale Bildgebung, erkennt diese Anzeige platzen Superoxid-Produktion Veranstaltungen, namens Superoxid Wallungen, in Einzel Mitochondrien intakter Zellen. Superoxid-Flash dient als eine zusammengesetzte Funktion der mitochondrialen Atmung, vorübergehende Begleitmitochondrienmembran Depolarisation und ROS-Produktion ^17-20. Kürzlich haben wir die pan-Gewebe mt-cpYFP transgenen Mäusen mit dem pUC-CAGGS-mt-cpYFP Vektor ^17,19 auf C57/BL6 Hintergrund generiert und verifiziert die starken Ausdrucksion dieses Indikators in Herz, Skelettmuskeln und anderen Geweben (Abbildung 2). Die transgenen Mäuse werden auf Anfrage und MTA Genehmigung durch die Universität von Washington sein für interessierte akademischen Forschern zur Verfügung.

In dieser Studie beschreiben wir in situ-Bildgebung von Superoxid blinkt Langendorff perfundierten Herzen als auch in vivo-Abbildung von von Blitzereignissen in der Skelettmuskulatur von betäubten mt-cpYFP transgenen Mäusen ^17,19. Diese Technologie ermöglicht die Echtzeitüberwachung der einzelnen mitochondrialen ROS-Produktion Ereignisse in einem physiologisch relevanten Bedingungen oder in vivo ^21,22. Es ist auch möglich, das System zu verwenden, um andere einzelne Parameter wie mitochondriale Membranpotential und Calcium mit geeigneten fluoreszierenden Indikatoren. Ferner gleichzeitige oder parallele Auswertung der mitochondrialen Funktion mit intrazelluläre Ereignisse (z. B. Calcium Transienten) oder Herzfunktion (z. B.. Ejektionsfraktion) erreicht werden. Pathologischen Störungen, wie Ischämie und Reperfusion kann perfundierten Herzen angewandt werden, um die Auswirkungen von Stress auf die einzelnen mitochondrialen Funktion im intakten Myokard zu beurteilen.

Protocol

1. Experiment Vorbereitung Bereiten Sie die isotonische balancierte Salzlösung (50 ml), enthaltend 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES (pH 7,2) für die in vivo-Bildgebung Skelettmuskel. Herstellung von 1 l Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) enthält: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 0,5 mM EDTA und 25 mM NaHCO3. Blasen die KHB mit Gas, das 95% O 2/5% CO &sub2; für 10-15 min vor der Zugabe …

Representative Results

Gemäß diesem Protokoll können in vivo Bildgebung von Einzel mitochondriale Ereignisse in der Skelettmuskulatur von betäubten Mäusen durchgeführt werden, gefolgt von in situ-Bildgebung in perfundierten Herzen (Fig. 1). Die optimale Einstellung der Aufnahmebedingungen wird dafür sorgen, klare Bilder der intakten Muskeln und mit Einzel Mitochondrium Auflösung (Abbildung 2). TMRM wird oft verwendet, um die Position der mt-cpYFP überprüfen und sollte eine vollstä…

Discussion

Imaging Einzel mitochondriale Ereignisse in lebenden Tier oder durchbluteten Organen hat erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden für die mitochondriale Funktion Auswertung ^{17,19,21,22,24,25.} Die hier beschriebene Technik kann Echtzeit-in-situ-Bestimmung der mitochondrialen Funktion in einem echten physiologischen Zustand auf subzellulärer Auflösung zu erreichen. Dies ist besonders nützlich, wenn sie mit anderen Messungen kombiniert werden, um systemisch Studium der Rolle von Mitoch…

Materials

			REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
			[header]
			EQUIPMENT
			Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.