VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost
Summary
Indotta da virus silenziamento genico è uno strumento utile per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost delle piante. Dimostriamo l'uso di agenti patogeni batterici che esprimono GFPuv nell'identificazione di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Questo approccio è semplice, veloce e facilita lo screening su larga scala e di protocollo simili possono essere applicati a studiare varie altre interazioni pianta-microbo.
Abstract
Nonhost resistenza alle malattie delle piante contro i batteri patogeni è controllato da meccanismi di difesa complessi. La comprensione di questo meccanismo è importante per lo sviluppo di piante resistenti alle malattie durevoli contro un'ampia gamma di patogeni. Indotta da virus silenziamento genico (VIGS) a base di genetica diretta screening è un approccio utile per l'identificazione di geni di difesa delle piante imprimere resistenza nonhost. Virus sonaglio tabacco (TRV) a base di VIGS vettore è il più efficiente VIGS vettore ad oggi ed è stato utilizzato in modo efficiente per silenziare geni bersaglio endogeni in Nicotiana benthamiana.
In questo manoscritto, dimostriamo un approccio prospettico di screening genetico per il silenziamento di singoli cloni da una libreria di cDNA in N. benthamiana e valutare la risposta del gene piante silenziate per resistenza nonhost compromessi contro i patogeni nonhost, Pseudomonas syringae pv. pomodoro T1, P. syringae pv. glycINEA, e X. campestris pv. vesicatoria. Questi agenti patogeni batterici sono progettati per esprimere proteine GFPuv e le loro colonie verde fluorescenti possono essere visti ad occhio nudo sotto la luce UV in nonhost piante inoculate patogeni se il gene bersaglio tacere è coinvolto in impartire resistenza nonhost. Questo facilita l'identificazione affidabile e più veloce di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Inoltre, promettente informazioni gene candidato può essere conosciuto con il sequenziamento del gene inserto centrale in TRV vettore. Qui mostriamo la capacità di throughput elevato di VIGS-mediate genetica avanti per identificare i geni coinvolti nella resistenza nonhost. Approssimativamente, 100 cDNA possono essere messi a tacere singolarmente in circa due o tre settimane e la loro rilevanza nella resistenza nonhost contro diversi batteri patogeni nonhost può essere studiato in una settimana dopo. In questo manoscritto, annoveriamo i passaggi dettagliati coinvolti in questo screening. VIGS-mediata genetica diretta screening approccio può essere esteso non solo ai geni coinvolti nella resistenza identificativi nonhost ma anche per studiare geni impartendo diverse tolleranze di stress biotico e abiotico in diverse specie vegetali.
Introduction
Nonhost resistenza è la resistenza di tutte le specie vegetali da anelli di un particolare agente patogeno 1,2. Questo conferisce ampio spettro e durevole resistenza alle malattie nelle piante 2,3. Tuttavia, il suo meccanismo, in particolare contro batteri patogeni, non è ben compreso 4. Screening per mutanti o piante tacere che la resistenza nonhost compromesso, e l'alta velocità trascrizione profiling per l'identificazione di geni differenzialmente espressi durante la resistenza nonhost 5-9 sono due principali approcci precedentemente utilizzati per sezionare batterica resistenza nonhost. Perché la resistenza nonhost è controllato da un complesso meccanismo (s) 4 con il coinvolgimento di molti geni, un approccio genomica funzionale di throughput elevato per l'identificazione di geni è fondamentale per una migliore comprensione del meccanismo di resistenza nonhost (s).
Indotta da virus silenziamento genico (VIGS) è stato utilizzato con successo per mettere a tacere pianta endogenageni in molte specie vegetali 10,11. Nicotiana benthamiana è una delle migliori piante adatte per VIGS 10,12 e il suo progetto di sequenza del genoma è ora disponibile 13. virus sonaglio tabacco (TRV) basati VIGS è stato ampiamente utilizzato come strumento di genetica inversa per caratterizzare i geni coinvolti nella resistenza nonhost 2,4,14. Questo VIGS vettori e derivati sono ora disponibili attraverso Arabidopsis Centro di Risorse Biologiche (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS è stato utilizzato anche come strumento di genetica in avanti per identificare geni coinvolti nella immunità pianta 15-17, resistenza soprattutto nonhost 6,18. Valutare la risposta ipersensibile (HR)-mediata morte cellulare indotta da piante contro uno specifico agente patogeno nonhost e valutare la malattia la morte cellulare indotta sono due importanti saggi utilizzati principalmente per identifying gene suscettibile tacere piante. Tuttavia, la morte delle cellule umane è indotta solo contro di tipo II nonhost patogeni e non contro le tipo-I nonhost patogeni 2. Quindi, le analisi delle risorse umane non può essere usato universalmente per identificare strategie di resistenza nonhost utilizzati dalle piante, in particolare contro un'ampia gamma di tipo-I nonhost patogeni. Inoltre, la perdita parziale della resistenza nonhost in un gene silenziato impianto non sempre porta a sintomi di malattia 6 e quindi di punteggio malattia non può essere utilizzato per identificare le piante compromettenti resistenza nonhost. In contrario, valutare la crescita dei patogeni nonhost nelle piante silenziate gene è un metodo migliore per studiare la perdita di resistenza nonhost nel gene piante silenziate.
Rispetto al saggio di crescita convenzionale 6,19, un metodo più veloce per valutare la crescita batterica nonhost sulle piante silenziate gene può ridurre il tempo richiesto per genetica diretta screening. Abbiamo precedentemente riportato un metodo per osservare i batteril crescita patogeno su foglie da occhio nudo sotto ultravioletta (UV) utilizzando batteri esprimenti proteina fluorescente verde (GFP) 19. In questo manoscritto si dimostra l'utilità di GFPuv esprimere patogeni batterici nonhost per una facile identificazione di geni silenziati piante che sono compromesse per la resistenza nonhost. Questa metodologia è accurata per l'identificazione delle piante sensibili e suscettibili di screening ad alto rendimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunità impianto limita la crescita di patogeni nonhost e, quindi, poca o nessuna fluorescenza verde è emessa da impianti di controllo vettoriale foglie inoculate con patogeni nonhost sotto luce UV di lunghezza d'onda lunga (Figura 3D). Tuttavia, quando un gene coinvolto nella resistenza nonhost viene messo a tacere, le piante silenziate gene favoriscono la crescita di nonhost fluorescenza patogeno e verde è visto (Figura 3E). Questo è il principio di base coinvolti nel metodo …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dalla Fondazione Samuel Roberts Noble. Autori ringraziano Mss. Janie Gallaway e Colleen Elles per un'eccellente cura delle piante, e la signora Katie Brown per opere d'arte. Vorremmo anche ringraziare Mss. Trina Cottrell, Pooja Uppalapati, Moumita Saha, Swetha Vinukonda e il signor Isaac Greenhut per assistenza tecnica durante istituzione di questo protocollo.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 96-well U-bottom plates | Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA) | 35-3077 | |
| 96-pin replicator stainless steel | Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA) | 250520 | |
| High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap | Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA) | 6283K50 | Manufacturer ID 95-0127-01 |
| Stuart SC6 colony counter | Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK | SC6PLUS | |
| Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350 | SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA) | ||
| Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT) |
Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA) | Custom synthesized | |
| MES, Monohydrate | VWR international (Radnor, PA, USA) | CAS No. 145224-94-8 | |
| Acetosyringone (Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D134406 | |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) | Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA) | VIS-30 |
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