Inducida por el virus de silenciamiento génico es una herramienta útil para la identificación de genes implicados en la resistencia de las plantas hospedantes. Se demuestra el uso de patógenos bacterianos que expresan GFPuv en la identificación de genes silenciados plantas susceptibles a los agentes patógenos no hospedantes. Este método es fácil, rápido y facilita la detección a gran escala y protocolo similar se puede aplicar al estudio de otras interacciones planta-microorganismo.
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Artículo de método
VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped
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Resumen
Resumen
No hospedantes resistencia a las enfermedades de las plantas frente a patógenos bacterianos es controlado por las vías de defensa complejas. La comprensión de este mecanismo es importante para el desarrollo de plantas resistentes a las enfermedades duraderas contra la amplia gama de patógenos. Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) basado en la detección genética hacia adelante es un enfoque útil para la identificación de genes que confieren resistencia a la defensa de las plantas no huésped. Virus del cascabel del tabaco (TRV) vector basado en VIGS es el vector más eficiente VIGS hasta la fecha y se ha utilizado de manera eficiente para silenciar genes diana endógenos en Nicotiana benthamiana.
En este manuscrito, se demuestra un método de detección genética adelante para el silenciamiento de clones individuales de una biblioteca de ADNc de N. benthamiana y la evaluación de la respuesta de las plantas silenciadas de genes para la resistencia no huésped frente a patógenos comprometida no hospedantes, Pseudomonas syringae pv. tomate T1, P. syringae pv. glycINEA y X. campestris pv. vesicatoria. Estos patógenos bacterianos están diseñados para expresar proteínas GFPuv y sus colonias fluorescentes verdes se pueden ver a simple vista bajo luz UV en las plantas inoculadas no hospedantes de patógenos si el objetivo de genes silenciados está implicado en la difusión de la resistencia no huésped. Esto facilita la identificación fiable y más rápida de las plantas de genes silenciados no hospedantes susceptibles a los agentes patógenos. Además, la información gen candidato prometedor puede ser conocido por la secuenciación del inserto de genes de plantas en TRV vectorial. Aquí se demuestra la capacidad de alto rendimiento de la genética hacia adelante VIGS mediadas para identificar los genes implicados en la resistencia no hospedante. Aproximadamente, 100 ADNc pueden ser silenciados individualmente en alrededor de dos a tres semanas y su importancia en la resistencia de no huésped frente a varios patógenos bacterianos no hospedantes pueden ser estudiados en una semana a partir de entonces. En este manuscrito, enumeramos los pasos detallados que participan en esta prueba. Adelante VIGS mediada genética Screening enfoque se puede extender no sólo a la identificación de los genes implicados en la resistencia no huésped, sino también para el estudio de los genes que imparten varias tolerancias de estrés biótico y abiótico en varias especies de plantas.
Introducción
Resistencia no hospedantes es la resistencia de todas las especies de plantas contra razas de un patógeno en particular 1,2. Esto imparte amplio espectro y resistencia a las enfermedades en las plantas duradera 2,3. Sin embargo, su mecanismo, en particular contra patógenos bacterianos, no se entiende bien 4. La detección de mutantes o plantas silenciadas que la resistencia de no huésped de compromiso, y de alto rendimiento de perfiles de transcripción para la identificación de genes expresados diferencialmente durante la resistencia no hospedante 5-9 son dos enfoques principales usados anteriormente para la disección de....
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Protocolo
1. Crecimiento de las plantas y Target Silenciador del Gen
- Las condiciones de crecimiento de las plantas:
- Siembre N. semillas benthamiana en suelo-menos mezcla para macetas, Metro-Mix 350 y germinar las semillas en una cámara de crecimiento. Cualquier otro suelo o suelo-menos medio también se pueden utilizar en lugar de Metro-Mix.
- Trasplante de tres semanas de edad plantas de semillero en macetas individuales y crecer en un invernadero mantenido a 21 ± 2 ° C junto con otras condiciones de crecimiento, como se detalla en la literatura anterior 12. Dos a tres días después del trasplante, las plantas se pueden u....
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Resultados
Objetivo principal de este estudio es demostrar un método para la identificación fácil y precisa de genes silenciados N. benthamiana plantas que están comprometidos para la resistencia no huésped. Hay cuatro pasos principales en esta metodología. El primer paso es silenciar individualmente gran número de genes utilizando TRV-VIGS. Habíamos silenciada alrededor de 5.000 genes de 6,18 durante un período de alrededor de 1,5 años utilizando el protocolo representado en la Figura 1. Algun.......
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Discusión
Planta de inmunidad limita el crecimiento de patógenos no hospedantes y por lo tanto, poco o nada de fluorescencia verde se emite desde la planta de control de vectores de hojas inoculadas con patógenos no hospedante bajo luz UV de longitud de onda larga (Figura 3D). Sin embargo, cuando un gen implicado en la resistencia de no huésped es silenciada, las plantas de genes silenciados favorecen el crecimiento de la fluorescencia verde y no hospedante patógeno se ve (Figura 3E). Este es el .......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por la Fundación Samuel Roberts Noble. Los autores agradecen a Mss. Janie Gallaway y Colleen Elles para un excelente cuidado de las plantas, y la Sra. Katie Brown para las ilustraciones. También nos gustaría dar las gracias a Mss. Trina Cottrell, Pooja Uppalapati, Moumita Saha, Swetha Vinukonda y el Sr. Isaac Greenhut ayuda técnica durante la creación de este protocolo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas inferiores en U de 96 pocillos | Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, EE. UU. | )35-3077 | |
| Replicador de acero inoxidable de 96 pines | Nalge Nunc International (Naperville, IL, EE. UU.) | 250520 | |
| Lámparas de inspección UV de alta intensidad, modelo B-100ap | Thomas scientific (Swedesboro, NJ, EE. UU.) | 6283K50 | ID del fabricante 95-0127-01 |
| Contador | de colonias Stuart SC6Bibby Scientific Limited, Staffordshire, Reino Unido | SC6PLUS | |
| Mezcla para macetas sin tierra, Metro-Mix 350 | SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, EE. UU.) | ||
| Imprimaciones: attB1 (GGGGACAAGTTTACAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT) | Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, EE. UU.) | Mees sintetizado | |
| , monohidrato | VWR international (Radnor, PA, EE. UU.) | N.º CAS 145224-94-8 | |
| Acetosiriringona (Dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) | D134406 | |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) | Lehle Seeds (Round Rock, TX, EE. UU.) | VIS-30 |
Referencias
- Heath, M. C. Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Currrent Opinion in Plant Biology. 3, 315-319 (2000).
- Mysore, K. S., Ryu, C. -M. Nonhost resistance: how much do we know. Trends in Plant Science. 9, 97-104 (2004).
- Ellis, J.
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Reimpresiones y permisos
