Glutamine Flux Imaging Met behulp van genetisch gecodeerde Sensoren
Summary
Dit artikel laat zien hoe u glutamine dynamiek in levende cellen met behulp van FRET. Genetisch gecodeerde sensoren mogelijk real-time monitoring van biologische moleculen op een subcellulaire resolutie. Experimenteel ontwerp, technische specificaties van de experimentele instellingen, en overwegingen voor post-experimentele analyses voor genetisch gecodeerd glutamine sensoren worden besproken.
Abstract
Genetisch gecodeerde sensoren mogelijk real-time monitoring van biologische moleculen op een subcellulaire resolutie. Een enorme verscheidenheid van dergelijke sensoren voor biologische moleculen werd in de afgelopen 15 jaar, waarvan werd onmisbare gereedschappen die routinematig worden gebruikt in veel laboratoria.
Een van de interessante toepassingen van genetisch gecodeerde sensoren is het gebruik van deze sensoren bij het onderzoek cellulaire transportprocessen. Eigenschappen van vervoerders zoals kinetiek en substraatspecificiteiten kan worden onderzocht op een cellulair niveau, mogelijkheden te bieden voor celtype specifieke analyses van transportactiviteiten. In dit artikel zullen we zien hoe transporter dynamiek kan worden waargenomen met behulp van genetisch gecodeerd glutamine sensor als voorbeeld. Experimenteel ontwerp, technische specificaties van de experimentele instellingen, en overwegingen voor post-experimentele analyses zullen worden besproken.
Introduction
Door opmerkelijke vooruitgang in technologie die onderzoek van de transcriptoom en proteoom op celniveau toelaat, is het nu duidelijk dat de biochemie en de resulterende flux van metabolieten en ionen zijn zeer specifiek celtype. Bijvoorbeeld, in de lever van zoogdieren, sequentiële glutamine afbraak en synthese gelijktijdig uitgevoerd door periportale cellen en periveneuze cellen respectievelijk toevoeren ammonium om het ureum cyclus in het eerste type cel en verbruikt overmaat ammoniak in de laatste 1-3. In sommige gevallen is significant biochemische heterogeniteit waargenomen zelfs in een "celtype" 4, 5. Naast dergelijke ruimtelijke specificiteit, de cellulaire niveaus van metabolieten en ionen die aan snelle veranderingen (bijv. signaalmoleculen zoals Ca2 + en cyclische nucleotiden). De spatiotemporele metabolieten en ionen spelen vaak cruciale rol in signaaltransductie. MMonitoring van cellulaire dynamiek van metabolieten en ionen, echter, vormen unieke uitdaging. In veel gevallen de verandering in concentraties snelle en voorbijgaande, geïllustreerd door het geval van signalerende moleculen zoals Ca2 +, die vervalt binnen ~ 20 msec dendritische 6. Bovendien compartimentering van biochemische pathways in en tussen de cellen maakt het moeilijk om de dynamiek van metabolieten en ionen kwantificeren middels extractie en chromatografie / massaspectrometrie technieken.
Genetisch gecodeerde sensoren voor biologische moleculen worden nu op grote schaal gebruikt vanwege de hoge spatiotemporal resolutie waarmee de experimentator om kortstondige en / of gecompartimenteerde moleculaire dynamica te bestuderen (beoordeeld 7, 8). Deze genetisch gecodeerde sensoren kunnen grofweg worden onderverdeeld in twee categorieën; intensiteit gebaseerde sensoren en ratiometic sensoren. Intensiteit gebaseerde sensoren bestaan doorgaans uit een bindend domein en een grieporescent eiwit (FP), en de opgeloste binding aan het bindingsdomein verandert de fluorescentie-intensiteit. Ratiometic sensoren, daarentegen, vaak gebruik maken van Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee KP die functioneren als FRET-paar. Deze sensoren bestaan uit een bindend domein en twee KP's, en de opgeloste stof binding induceert de verandering in de FRET efficiëntie tussen de twee KP's. Een groot aantal sensoren voor biologische belangrijke metabolieten en ionen ontwikkeld in het afgelopen decennium 8, 9.
Een van de interessante mogelijkheid die zodanig genetisch gecodeerde sensoren is hun gebruik in de hoge-resolutie analyse van membraantransport processen die voorheen moeilijk te detecteren op cellulair niveau. Genetisch gecodeerde sensoren vergemakkelijken de analyse van mechanismen vervoer, zoals substraat specificiteit en pH-afhankelijkheid 10, 11. Bovendien, in combinatie met de genetische resRONNEN zoals de bibliotheek van RNAi constructen voor modelorganismen, is het nu mogelijk om genoom-brede bevragen voor nieuwe transportprocessen met genetisch gecodeerde sensoren. Inderdaad, het gebruik van genetisch gecodeerde sensor aan de ontdekking van eerder gekenmerkte transporters in meerdere gevallen 12, 13.
Onlangs heeft ons laboratorium een reeks van FRET-gebaseerde sensor voor glutamine ontwikkeld. We hebben aangetoond dat cellulaire glutamine niveaus kunnen worden gevisualiseerd met behulp van dergelijke FRET glutamine sensoren 10. Deze sensoren omvatten een FRET-donor (mTFP1) ingebracht in een bacterieel glutamine bindingseiwit glnH en een FRET acceptor (venus) en de C-termini van glnH (figuur 1). FRET efficiëntie van deze sensoren verminderen na binding van glutamine, waardoor de afname van acceptor / donor intensiteitverhouding. Fijnregeling glutamine transportprocessen belangrijk in biologische processen zoals neurotransmissie 14, 15 en het behoud van ureum cyclus in de lever 1, 16, 17.
Hier laten we de methodologie voor het analyseren van transportactiviteiten met FRET sensoren voor glutamine, met behulp van een wide-field fluorescentie microscoop set-up. Het doel van de experimenten hier moeten transporter activiteiten op te sporen in een vak en substraatspecificiteit van een tijdelijk tot expressie transporter onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het succes van beeldvormende experimenten hangt af van een aantal kritische factoren. Een van deze factoren is de affiniteit van sensoren, zoals hierboven besproken. Absolute concentratie van het substraat in het subcellulaire compartiment van belang is echter vaak onbekend. Daarom raden we proberen meerdere sensoren met verspringende affiniteiten aan degene die het beste werkt onder de gewenste experimentele conditie te vinden. Bijvoorbeeld, in ons geval hebben we de getransfecteerde COS7 cellen met glutamine sensoren …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie 1R21NS064412, NSF subsidie 1.052.048 en Jeffress Memorial Trust subsidie J-908.
Materials
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate. |
| Exitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | band width 450-460 nm |
| Exitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | band width 475-505nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | band width 520-550nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | long pass, 470nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH3008703 | |
| penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | sigma | P4707 | |
| 25mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | in case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used |
| Solution A (Hank's buffer) | – | – | 9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH |
| Solution B | Solution A + 0.04mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5mM Ala |
Referencias
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D. Hepatic glutamine metabolism. Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. Hepatic glutamine metabolism. Nutrition. 18, 301-303 (2002).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
