遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング
Summary
この記事では、FRETを使用して、生細胞内のグルタミンダイナミクスを監視する方法を紹介します。遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が遺伝的にコードされたグルタミンセンサに議論される。
Abstract
遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。生物学的分子のためのようなセンサの驚異的な様々な多くの研究室で日常的に使用される不可欠なツールとなったそのうちのいくつかは、過去15年で利用可能となりました。
遺伝的にコードされたセンサの刺激的な用途の一つは、細胞輸送プロセスを調査において、これらのセンサの使用である。そのような動態および基質特異性などの輸送体の特性は、輸送活性の細胞型特異的な分析の可能性を提供し、細胞レベルで調べることができる。この記事では、トランスポーターのダイナミクスは、一例として、遺伝的にコードされグルタミンセンサーを使用して観察することができる方法を紹介します。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が議論される。
Introduction
により細胞レベルでのトランスクリプトームやプロテオームの検査を可能にする技術の目覚しい進歩により、現在では、生化学および代謝物とイオンの結果としてフラックスは非常に細胞型特異的であることが明らかになってきた。例えば、哺乳動物の肝臓において、シーケンシャルグルタミン分解及び合成は、後者1-3で過剰のアンモニアを消費しながら、前者の細胞型において尿素サイクルにアンモニアを供給し、それぞれ門脈周囲細胞および静脈周囲の細胞によって同時に行われる。いくつかの場合において、重要な生化学的異質性は、単一の「細胞型」4,5で検出される。このような空間的な特異性に加えて、代謝産物およびイオンの細胞レベル（ 例えば、例えばCa 2 +および環状ヌクレオチドなどのシグナル伝達分子）は非常に動的である。代謝産物およびイオンの時空間パターンは、多くの場合、シグナル伝達に重要な役割を果たす。 M代謝物やイオンの細胞動態をonitoringしかし、ユニークな課題をもたらす。多くの場合、濃度の変化は、迅速かつ一過性の、例えば、樹状突起棘6〜20ミリ秒以内に減衰のCa 2 +のようなシグナル伝達分子の場合が例示される。さらに、細胞内および間の生化学的経路の区画化が困難抽出およびカラムクロマトグラフィー/質量分析技術を用いて代謝産物およびイオンのダイナミクスを定量化することができる。
生物学的分子のための遺伝的にコードされたセンサーは、現在広くにより実験者が（7、8に概説されている）短命および/ または区画化された分子動力学を研究することを可能にする、高時空間解像度に使用されている。これらの遺伝的にコードされたセンサーは、大きく2つのカテゴリに分けることができ;強度ベースのセンサとratiometicセンサー。強度ベースのセンサは、通常、結合ドメインやインフルエンザで構成されてorescentタンパク質（FPS）、および結合ドメインに結合する溶質は、蛍光強度が変化します。 Ratiometicセンサは、一方で、多くの場合、FRETペアとして機能する2つのFPとの間のフォスター共鳴エネルギー移動（FRET）を利用する。これらのセンサは、結合ドメイン二つのFPからなり、溶質の結合は、2つのFPとの間のFRET効率の変化を誘導する。生物学的に重要な代謝産物およびイオンのための多数のセンサは、過去10年間8,9開発されている。
そのような遺伝的にコードされたセンサによって提供される刺激的な可能性の一つは、以前に、細胞レベルで検出することは容易ではなかった膜輸送プロセスの高分解能分析におけるそれらの使用である。遺伝的にコードされたセンサは、基質特異性およびpH依存10,11等の搬送機構の分析を容易にする。また、遺伝的RESとの組み合わせでRNAiのライブラリがモデル生物のために構築ourcesこのように、それは遺伝的にコードされたセンサーを用いた新規輸送プロセスのためのゲノムワイドな検索を行うことができるようになりました。実際、複数のケースで以前に特徴づけられていない輸送体の発見に遺伝的にコード化されたセンサリードの使用12、13。
最近、私たちの研究室では、グルタミンのためのFRETに基づくセンサーのシリーズを開発しました。我々は、細胞のグルタミンレベルが例えばFRETグルタミンセンサ10を用いて可視化することができることを実証した。これらのセンサは、glnHのC末端（ 図1）での細菌グルタミン結合タンパク質glnHに挿入されたFRETドナー（mTFP1）、およびFRETアクセプター（ヴィーナス）から構成されています。これらのセンサのFRET効率は、アクセプター/ドナー強度比の減少をもたらす、グルタミンの結合時に減少する。グルタミン輸送プロセスの微調整は、例えばneurotransmなどの生物学的プロセスにおいて重要であるission 14,15および肝臓1、16、17における尿素サイクルの維持。
ここでは、広視野蛍光顕微鏡セットアップを使用して、グルタミンFRETセンサーを輸送活性を分析する方法論を示す。ここに示された実験の目的は、単一の細胞においてトランスポーター活性を検出し、一過性に発現トランスポーターの基質特異性を検討することである。
Protocol
Representative Results
Discussion
イメージング実験の成功は、いくつかの重要な要因に依存します。これらの要因の一つは、上述したように、使用されるセンサの親和性である。関心対象の細胞内区画中の基質の絶対濃度は、しかしながら、多くの場合不明である。そこで我々は、目的の実験条件の下で最適なものを見つけるために千鳥親和性を有する複数のセンサを試してみることをお勧め。例えば、我々の場合、我々は1…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの助成金1R21NS064412、NSFの助成金1052048とJeffressメモリアル·トラスト助成金、J-908でサポートされていました。
Materials
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate. |
| Exitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | band width 450-460 nm |
| Exitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | band width 475-505nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | band width 520-550nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | long pass, 470nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH3008703 | |
| penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | sigma | P4707 | |
| 25mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | in case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used |
| Solution A (Hank's buffer) | – | – | 9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH |
| Solution B | Solution A + 0.04mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5mM Ala |
Referencias
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