La glutammina Flux Imaging Utilizzando sensori geneticamente codificato

Summary

In questo articolo verrà illustrato come monitorare le dinamiche di glutammina in cellule vive usando FRET. I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi per i sensori di glutammina geneticamente codificati.

Abstract

I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Una enorme varietà di tali sensori per molecole biologiche si sono resi disponibili negli ultimi 15 anni, alcuni dei quali divenne strumenti indispensabili che vengono utilizzati di routine in molti laboratori.

Una delle interessanti applicazioni di sensori geneticamente codificati è l'uso di questi sensori nelle indagini processi di trasporto cellulari. Proprietà dei trasportatori come cinetica e specificità di substrato possono essere studiati a livello cellulare, fornendo possibilità di cellula di tipo analisi specifiche delle attività di trasporto. In questo articolo, vedremo dimostrare come la dinamica dei trasportatori possono essere osservate con sensore di glutammina geneticamente codificato come un esempio. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi.

Introduction

A causa di notevoli progressi nelle tecnologie che consente l'esame del trascrittoma e proteoma a livello cellulare, ora è diventato chiaro che la biochimica e la conseguente flusso di metaboliti e ioni sono altamente tipo cellulare specifico. Ad esempio, nel fegato di mammiferi, degradazione glutammina sequenziale e sintesi vengono effettuate simultaneamente dalle cellule periportale e cellule perivenose rispettivamente, alimentando ammonio al ciclo dell'urea nel primo tipo di cellula consumando eccesso di ammoniaca in quest'ultimo ^1-3. In alcuni casi, una significativa eterogeneità biochimica viene rilevato anche in un unico "tipo cellulare" ^{4, 5.} Oltre a questa particolarità spaziale, i livelli cellulari di metaboliti e ioni sono altamente dinamici (per esempio, molecole di segnalazione come Ca ^{2 +} e nucleotidi ciclici). I modelli spazio-temporali dei metaboliti e ioni giocano spesso un ruolo critico nella trasduzione del segnale. MONITORAGGIO dinamiche cellulari di metaboliti e ioni, tuttavia, pongono sfida unica. In molti casi la variazione delle concentrazioni sono rapido e transitorio, esemplificato dal caso di molecole di segnalazione come Ca ^{2 +,} che decade entro ~ 20 msec in spine dendritiche ^6. Inoltre, compartimentazione di vie biochimiche all'interno e tra le cellule rende difficile quantificare le dinamiche di metaboliti e ioni con estrazione e cromatografia su colonna / tecniche di spettrometria di massa.

Sensori geneticamente codificate molecole biologiche sono ora ampiamente utilizzati a causa della alta risoluzione spazio-temporale che permette lo sperimentatore di studiare dinamica molecolare di breve durata e / o compartimenti (recensiti ^{7, 8).} Questi sensori geneticamente codificati possono grossolanamente essere suddivisi in due categorie; sensori basati sull'intensità e sensori ratiometic. Sensori basati intensità, in genere costituiti da un dominio di legame e l'influenzaproteina orescent (PQ), e il legame al dominio di legame soluto cambia l'intensità fluorescente. Sensori Ratiometic, d'altra parte, spesso sfruttano Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra due PQ che fungono da coppia FRET. Questi sensori sono costituiti da un dominio di legame e due PQ, e il legame soluto induce la variazione di efficienza FRET tra i due PQ. Un gran numero di sensori per biologicamente importanti metaboliti e ioni sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni ^{8, 9.}

Una delle eccitante possibilità offerta da tali sensori geneticamente codificati è il loro uso nell'analisi ad alta risoluzione di processi di trasporto di membrana, che in precedenza non era facile individuare a livello cellulare. Sensori geneticamente codificati facilitano l'analisi dei meccanismi di trasporto come specificità di substrato e pH dipendenza ^{10, 11.} Inoltre, in combinazione con i res geneticheONTI come la biblioteca di RNAi costruisce per organismi modello, è ora possibile effettuare ricerche genome-wide per i processi di trasporto innovativi che utilizzano sensori geneticamente codificati. Infatti, l'uso di organismi geneticamente codificato cavo del sensore alla scoperta dei trasportatori in precedenza non caratterizzate in più casi ^{12, 13.}

Recentemente, il nostro laboratorio ha sviluppato una serie di sensori basati su FRET per la glutammina. Abbiamo dimostrato che i livelli di glutammina cellulare può essere osservata con tali sensori FRET glutammina ^10. Questi sensori sono costituiti da un donatore FRET (mTFP1) inserito in un batterica proteina legante glutammina glnH, e un accettore FRET (venus) al C-terminali di glnH (Figura 1). FRET efficienza di questi sensori diminuire in seguito al legame di glutammina, con conseguente diminuzione del rapporto di intensità accettore / donatore. Belle regolazione dei processi di trasporto glutammina è importante nei processi biologici quali neurotransmissione ^{14, 15} e la manutenzione di ciclo dell'urea nel fegato ^{1, 16, 17.}

Qui vi mostriamo la metodologia di analisi delle attività di trasporto con sensori FRET per la glutammina, con un ampio campo di microscopio a fluorescenza set-up. Lo scopo degli esperimenti mostrato qui di rilevare attività trasportatore in una singola cella ed esaminare specificità di substrato di un trasportatore transitoriamente espressa.

Protocol

1. Preparazione del campione Nota: In molti casi gli esperimenti di perfusione lavare via una porzione significativa di cellule, che può diventare un problema frustrante. Sebbene non necessario per tutte le linee cellulari, superfici di vetro coperchio rivestimento con poli-L-lisina (aggiungere 1,0 ml/25 cm 2 di soluzione 0,01% in superficie, incubare> 5 min, lavare due volte con acqua di grado coltura cellulare, e secco l'armadio biosicurezza) migliora l'adesione cellul…

Representative Results

Tipici esperimenti time-corso sono rappresentati in Figura 2. In questi esperimenti, FRET sensori di glutammina con affinità di 8 mm (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 micron (μ FlipQTV3.0_100 C e D) sono stati co-espressi con un obbligatorio scambiatore amminoacido ASCT2 18 in cellule COS7 10. Afflusso di glutammina viene rilevato come variazione rapporti di intensità di fluorescenza tra il donatore (mTFP1) e l'accettore (venus) …

Discussion

Il successo di esperimenti di imaging dipende da alcuni fattori critici. Uno di questi fattori è l'affinità di sensori utilizzati, come discusso sopra. Concentrazione assoluta del substrato nel compartimento subcellulare di interesse, tuttavia, è spesso sconosciuta. Pertanto si consiglia di provare diversi sensori con affinità sfalsati per trovare quello che funziona meglio sotto la condizione sperimentale desiderato. Ad esempio, nel nostro caso abbiamo trasfettato cellule COS7 con sensori di glutammina con 1.5?…

Materials

Inverted fluorescent microscope	Olympus	IX81F-3-5	An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.
Exitation filter (mTFP1)	Omega Optical	3RD450-460	band width 450-460 nm
Exitation filter (Venus)	Chroma	ET500/20	band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1)	Chroma	HQ495/30m	band width 475-505nm
Emission filter (Venus)	Chroma	ET535/30m	band width 520-550nm
Dichroic mirror (FRET channels)	Chroma	470dcxr	long pass, 470nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel)	Chroma	89002bs	passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm
mCherry filter set	Chroma	49008	excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm
Light source	Olympus	U-LH100L-3-5	LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
apochromatic fluorescence objective	Olympus
perfusion system, ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers	C&L Instruments	VC-MPC-TW	Other larminar-flow chambers would also work
Chambered slide	Lab-Tek	154534	For open-chamber experiments
perfusion pump	Thermo Scientific	74-046-12131	For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements	Intellegenent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO2 Incubator	Thermo Scientific	13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)	Hyclone	SH30243.01
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH3008703
penicillin/streptomycin	Hyclone	SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)	Invitrogen	31985	Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution	sigma	P4707
25mm circular glass cover slips	Thermo Scientific	12-545-102	in case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Other transfection reagents can also be used
Solution A (Hank's buffer)	–	–	9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B			Solution A + 0.04mM Gln
Solution C			Solution A + 0.2mM Gln
Solution D			Solution A + 1mM Gln
Solution E			Solution A + 5mM Gln
Solution F			Solution A + 5mM Ala