Glutamina Flux Imaging utilizando sensores codificados genéticamente
Summary
Este artículo le mostrará cómo controlar la dinámica de glutamina en las células vivas mediante FRET. Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos para los sensores de glutamina codificados genéticamente.
Abstract
Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Una enorme variedad de tales sensores para moléculas biológicas se hizo disponible en los últimos 15 años, algunos de los cuales se convirtió en herramientas indispensables que se utilizan rutinariamente en muchos laboratorios.
Una de las emocionantes aplicaciones de sensores codificados genéticamente es el uso de estos sensores en la investigación de los procesos de transporte celulares. Propiedades de los transportistas, como la cinética y especificidades de sustrato se pueden investigar a nivel celular, que proporciona posibilidades de análisis específicos de tipo celular de las actividades de transporte. En este artículo, vamos a demostrar cómo la dinámica del transportador se pueden observar utilizando el sensor de glutamina codificado genéticamente como ejemplo. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos.
Introduction
Debido a la notable progreso en tecnologías que permite el examen del transcriptoma y el proteoma a nivel celular, ahora ha quedado claro que la bioquímica y el flujo resultante de los metabolitos y los iones son altamente tipo específico de célula. Por ejemplo, en el hígado de los mamíferos, la degradación y la síntesis de glutamina secuencial se llevan a cabo de forma simultánea por las células periportal y células perivenosos respectivamente, la alimentación de amonio para el ciclo de la urea en el primer tipo de células, mientras que consume el exceso de amoníaco en este último 1-3. En algunos casos, se detecta heterogeneidad bioquímica significativa incluso en un solo "tipo celular" 4, 5. Además de tales especificidad espacial, los niveles celulares de metabolitos e iones son altamente dinámico (por ejemplo, moléculas de señalización tales como Ca 2 + y nucleótidos cíclicos). Los patrones espacio-temporales de metabolitos e iones a menudo desempeñan un papel crítico en la transducción de señales. MONITOREO dinámica celular de metabolitos e iones, sin embargo, plantean desafío único. En muchos casos, el cambio en las concentraciones son rápida y transitoria, ejemplificada por el caso de moléculas de señalización tales como Ca 2 +, que se desintegra dentro de ~ 20 mseg en las espinas dendríticas 6. Además, la compartimentación de las rutas bioquímicas dentro y entre las células hace que sea difícil de cuantificar la dinámica de metabolitos e iones usando extracción y cromatografía en columna / técnicas de espectrometría de masas.
Sensores codificados genéticamente para moléculas biológicas son ampliamente utilizados debido a la alta resolución espacio-temporal que permite al experimentador para estudiar la dinámica molecular de corta duración y / o compartimentadas (revisado en 7, 8). Estos sensores codificados genéticamente pueden dividirse en dos categorías; sensores basados en la intensidad y sensores ratiometic. Sensores basados en la intensidad general consisten en un dominio de unión y una gripeproteína orescent (fps), y la unión al dominio de unión soluto cambia la intensidad fluorescente. Sensores Ratiometic, por otro lado, a menudo se aprovechan de Föster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos programas marco que funcionan como un par de FRET. Estos sensores consisten en un dominio de unión y dos programas marco, y la unión soluto induce el cambio en la eficiencia de FRET entre los dos programas marco. Un gran número de sensores para metabolitos e iones biológicamente importantes se han desarrollado en la última década 8, 9.
Una de la excitante posibilidad ofrecida por tales sensores codificados genéticamente es su uso en el análisis de alta resolución de los procesos de transporte de membrana, que anteriormente no era fácil de detectar en el nivel celular. Sensores codificados genéticamente facilitar el análisis de los mecanismos de transporte, tales como especificidad de sustrato y la dependencia de pH 10, 11. Por otra parte, en combinación con la res genéticosuentes como la biblioteca de RNAi construye de organismos modelo, ahora es posible realizar búsquedas en todo el genoma para nuevos procesos de transporte por medio de sensores codificados genéticamente. De hecho, el uso de cable del sensor codificado genéticamente para el descubrimiento de los transportadores de no caracterizados previamente en múltiples casos 12, 13.
Recientemente, nuestro laboratorio ha desarrollado una serie de sensores basados en FRET de glutamina. Hemos demostrado que los niveles de glutamina celular pueden ser visualizados usando tales sensores de glutamina de FRET 10. Estos sensores constan de un donante de FRET (mTFP1) insertado en una proteína bacteriana de unión glutamina glnH, y un aceptor de FRET (Venus) en el extremo C-terminal de glnH (Figura 1). FRET eficiencia de estos sensores a disminuir tras la unión de glutamina, lo que resulta en la disminución de la relación de intensidad de aceptor / donador. Fine regulación de los procesos de transporte de la glutamina es importante en los procesos biológicos, tales como neurotransmisión 14, 15 y el mantenimiento de ciclo de la urea en el hígado 1, 16, 17.
Aquí se presenta la metodología de análisis de las actividades de transporte con sensores FRET para glutamina, usando un campo amplio de fluorescencia microscopio puesta a punto. El objetivo de los experimentos que se muestran aquí son para detectar las actividades del transportador en una sola célula y para examinar la especificidad de sustrato de un transportador expresado transitoriamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
El éxito de los experimentos de imagen depende de algunos factores críticos. Uno de estos factores es la afinidad de sensores utilizado, como se discutió anteriormente. Concentración absoluta del sustrato en el compartimiento subcelular de interés, sin embargo, es a menudo desconocida. Por lo tanto le recomendamos probar múltiples sensores con afinidades escalonados para encontrar el que funciona mejor bajo la condición experimental deseado. Por ejemplo, en nuestro caso transfectadas las células COS7 con sensore…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención 1R21NS064412, subvención NSF 1052048 y Jeffress Memorial Trust subvención J-908.
Materials
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate. |
| Exitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | band width 450-460 nm |
| Exitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | band width 475-505nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | band width 520-550nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | long pass, 470nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH3008703 | |
| penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | sigma | P4707 | |
| 25mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | in case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used |
| Solution A (Hank's buffer) | – | – | 9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH |
| Solution B | Solution A + 0.04mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5mM Ala |
Referencias
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