גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים
Summary
מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.
Abstract
חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. מגוון עצום של חיישנים כאלה למולקולות ביולוגיות הפך זמין בשנים האחרונות 15, שחלקם הפך לכלי חיוני המשמשים באופן שיגרתי במעבדות רבות.
אחד היישומים המרגשים של חיישני מקודדים גנטי הוא השימוש בחיישנים אלה בחקירת תהליכי הובלה תאיות. מאפיינים של מובילים כגון קינטיקה וספציפיות מצע יכולים להיחקר ברמה תאית, המספקים אפשרויות לניתוחי תאים מסוג מסוימים של פעילות הובלה. במאמר זה, נדגים כיצד ניתן לצפות דינמיקת טרנספורטר באמצעות חיישן גלוטמין מקודד גנטי לדוגמא ירושלים. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו.
Introduction
בשל התקדמות מרשימה בטכנולוגיות המאפשרת בדיקה של transcriptome וproteome ברמה תאית, זה הפך כעת ברור כי ביוכימיה והשטף של מטבוליטים ויונים וכתוצאה מכך הם מאוד תאים מסוג ספציפי. לדוגמא, בכבד של היונקים, השפלה גלוטמין רציפה וסינתזה מתבצעות בו זמנית על ידי תאי periportal ותאי perivenous בהתאמה, האכלת אמוניום למעגל האוריאה בסוג התא לשעבר תוך צריכת אמוניה עודפת ב1-3 האחרון. במקרים מסוימים, את ההטרוגניות ביוכימיים משמעותית הוא זוהה גם ב" סוג תא "יחיד 4, 5. בנוסף לסגולי מרחבית כגון, הרמות תאיות של מטבוליטים ויונים הן מאוד דינמיות (למשל, מולקולות איתות כגון Ca 2 + ונוקלאוטידים מחזוריים). דפוסי spatiotemporal של מטבוליטים ויונים לעתים קרובות משחקים תפקיד קריטי בהעברת אותות. Monitoring דינמיקה הסלולר של מטבוליטים ויונים, לעומת זאת, מהווה אתגר ייחודי. במקרים רבים השינוי בריכוזים הם מהירים וחולפים, שהודגם על ידי המקרה של מולקולות איתות כגון Ca 2 +, אשר דועך בתוך ~ 20 אלפיות שניים בקוצים הדנדריטים 6. בנוסף, מידור של מסלולים ביוכימיים בתוך ובין התאים עושה את זה קשה לכמת את הדינמיקה של מטבוליטים ויונים באמצעות מיצוי וכרומטוגרפיה עמודה / טכניקות ספקטרומטריית מסה.
חיישני מקודד גנטי למולקולות ביולוגיות המשמשים כיום באופן נרחב בשל הרזולוציה spatiotemporal הגבוהה המאפשרת הנסיין ללמוד דינמיקה קצרת מועד ו / או ממודרת מולקולרית (הנסקרת ב 7, 8). בערך ניתן לחלק את חיישני מקודדים גנטי אלה לשתי קטגוריות; חיישנים מבוססי עוצמה וחיישני ratiometic. חיישנים מבוססי עוצמה בדרך כלל מורכבים של תחום מחייב ושפעתחלבון orescent (FPS), והמומס מחייב לתחום המחייב משנים את עוצמת הניאון. חיישני Ratiometic, לעומת זאת, מנצלים לעתים קרובות העברת פוסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני FPS המתפקדים כזוג סריג. חיישנים אלה כוללים תחום מחייב ושתי תמונות בשניה, והמומס המחייב גורם שינוי בסריג יעילות בין שתי תמונות בשניה. מספר גדול של חיישנים למטבוליטים ויונים חשובים מבחינה ביולוגית פותחו בעשור האחרון 8, 9.
אחת האפשרות מרגשת המוצע על ידי חיישני מקודדים גנטי כזה הוא השימוש שלהם בניתוח ברזולוציה הגבוהה של תהליכי הובלת קרום, שלא היה קל בעבר כדי לזהות ברמה התאית. חיישני מקודדים גנטי להקל על הניתוח של מנגנוני הובלה כגון סגוליות מצע וpH תלות 10, 11. יתר על כן, בשילוב עם מיל הגנטיources כגון הספרייה של RNAi בונה לאורגניזמים מודל, ניתן כיום לבצע חיפושי הגנום לתהליכי הובלת רומן באמצעות חיישנים מקודדים גנטי. ואכן, שימוש בעופרת חיישן מקודד גנטי לגילוי של מובילי uncharacterized בעבר במקרים רבים 12, 13.
לאחרונה, המעבדה שלנו פיתחה סדרה של חיישן מבוסס סריג לגלוטמין. אנחנו הוכיחו כי רמות גלוטמין הסלולרי ניתן דמיינו באמצעות חיישני גלוטמין סריג כזה 10. חיישנים אלה כוללים תורם סריג (mTFP1) מוכנס לתוך חלבון גלוטמין מחייב חיידקי glnH, וacceptor סריג (ונוס) בC-Termini של glnH (איור 1). סריג יעילות של חיישנים אלה להקטין על הכריכה של גלוטמין, וכתוצאה מכך הירידה של יחס עוצמת acceptor / תורם. ויסות עדינה של תהליכי הובלת גלוטמין היא חשובה בתהליכים ביולוגיים כגון neurotransm14 ission, 15 והתחזוקה של מחזור אוריאה בכבד 1, 16, 17.
כאן אנו מראים את המתודולוגיה של ניתוח פעילות תחבורה עם חיישני סריג לגלוטמין, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום ההגדרה. המטרה של ניסויים המוצגים כאן הן לזהות פעילויות טרנספורטר בתא בודד ולבחון את הספציפיות מצע של טרנספורטר הביע transiently.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההצלחה של ניסויי הדמיה תלויה בגורמים קריטיים כמה. אחד הגורמים הללו הוא הזיקה של חיישנים המשמשת, כפי שפורט לעיל. ריכוז מוחלט של המצע בתא subcellular של עניין, עם זאת, הוא לעתים קרובות לא ידוע. לכן אנו ממליצים לנסות חיישנים מרובים עם זיקות מעד למצוא אחד שפועל תחת תנאי ניסוי הר?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1R21NS064412, NSF מענק 1,052,048 וJeffress זיכרון אמון מענק J-908.
Materials
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate. |
| Exitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | band width 450-460 nm |
| Exitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | band width 475-505nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | band width 520-550nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | long pass, 470nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH3008703 | |
| penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | sigma | P4707 | |
| 25mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | in case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used |
| Solution A (Hank's buffer) | – | – | 9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH |
| Solution B | Solution A + 0.04mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5mM Ala |
Referencias
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D. Hepatic glutamine metabolism. Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. Hepatic glutamine metabolism. Nutrition. 18, 301-303 (2002).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
