Telomerase activiteit in de verschillende regio's van de hersenen van muizen: Non-Radioactive Telomerase Herhaal Amplification Protocol (TRAP) Assay
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
Telomerase, een ribonucleoproteïne, is verantwoordelijk voor het handhaven van de telomeerlengte en daarmee het bevorderen van genomische integriteit, proliferatie, en levensduur. Bovendien telomerase beschermt de mitochondriën tegen oxidatieve stress en resistentie tegen apoptose, suggereert de mogelijke betekenis voor de overlevende van niet-mitotische, zeer actieve cellen zoals neuronen. We hebben eerder werd aangetoond dat telomerase nieuwe activatoren telomerase activiteit en expressie in de verschillende muizen hersengebieden verhogen en motorische neuronen cellen tegen oxidatieve stress. Deze resultaten versterken het idee dat telomerase is betrokken bij de bescherming van neuronen uit verschillende letsels. Om de rol van telomerase in de hersenen onderstrepen we hier vergelijken de activiteit van telomerase in mannelijke en vrouwelijke muizenhersenen en de afhankelijkheid van de leeftijd. TRAP assay is een standaard methode voor het detecteren van telomerase-activiteit in verschillende weefsels of cellijnen. Hier laten we de analysis van telomerase-activiteit in drie gebieden van de hersenen van muizen door niet-denaturerende eiwit extractie middels CHAPS lysis buffer gevolgd door modificatie van de standaard TRAP assay.
In deze 2 stappen assay endogene telomerase verlengt specifieke telomerase substraat (TS primer) door toevoeging van TTAGGG 6 bp herhalingen (telomerase reactie). De telomerase reactieproducten worden versterkt door PCR-reactie het creëren van een DNA-ladder van stappen 6 bp. De analyse van de DNA ladder wordt door 4,5% hoge resolutie agarose gelelektroforese gevolgd door kleuring met zeer gevoelige nucleïnezuur vlek.
Vergeleken met de traditionele TRAP assay die gebruik 32 P gemerkt radioactief dCTP voor DNA detectie en polyacrylamide gelelektroforese oplossing van het DNA ladder Dit protocol biedt niet giftige tijdbesparende TRAP-assay voor het evalueren van telomerase-activiteit in de hersenen van muizen, tonen de mogelijkheid om detecteren verschillen in telomerase activiteit in de verschillende vrouwelijke en mannelijke regio muizenhersenen.
Introduction
Telomerase is een ribonucleoproteïne uit telomerase reverse transcriptase (TERT), de katalytische subeenheid van telomerase, en een RNA component (TERC). De canonieke rol van telomerase is de juiste lengte van de telomeren behouden door toevoeging van repetitieve sequenties (TTAGGG) de telomere eindigt derhalve bevordering genomische integriteit en celproliferatie 1. Aanvullende functies werden toegeschreven aan TERT in cellen, dwz resistentie tegen apoptose geïnduceerd door verschillende beschadigende middel 2 verleent beschermt menselijke mesenchymale stamcellen uit oxidatieve stress 3, en speelt een pro-survival rol in volledig gedifferentieerde neuronen door deelneming aan positieve RNA TIA1 granules 4.
TERT- wordt uitgedrukt en zich hoofdzakelijk bezighield met somatische delende cellen en in de meeste vormen van kanker, terwijl het enzym expressie en activiteit niveaus strak zijn geregeld in niet-delende cellen 5,6. Studies hebben aangetoond dat in de rOdent hersenen, telomerase-activiteit niet herkend door postnatale dag 10, terwijl TERT mRNA wordt op lagere niveaus in de volwassenheid 7. Andere studies toonden telomerase activiteit in de volwassen sub-ventriculaire zone, de bulbus olfactorius, de hippocampus en in de volwassen cortex en cerebellum 8. We hebben onlangs aangetoond dat nieuwe verbindingen die telomerase expressie en activiteit te verhogen in de hersenen en ruggenmerg uitgeoefend neuroprotectieve effecten in N-methyl-D-aspartaat (NMDA) – geïnjecteerde muizen vertraagde het ontstaan en de progressie van amyotrofische laterale sclerose ziekte in SOD1 transgene muizen en verhoogde de overleving van motorische neuronen in het ruggenmerg van deze muizen 9. Om volledig de pro-survival rol van telomerase in neuronen en in de hersenen, is het essentieel om een eenvoudige en relatief gevoelig snelle test voor het detecteren van telomerase-activiteit in de verschillende gebieden van de hersenen ontwikkelen.
De telomeer rEPEAT amplificatie protocol (TRAP) is een bekende gevoelige test combineert de canonieke activiteit van telomerase en de polymerase kettingreactie (PCR). In deze assay, telomerase voegt TTAGGG herhaalt een telomerase substraat (TS primer) oligonucleotide, gevolgd door PCR-amplificatie waarbij 6 baseparen (bp) DNA-ladder met de TS reverse primer genereert -. ACX 32P gemerkte dCTP worden gebruikt om te detecteren lage hoeveelheid PCR producten. De DNA ladder wordt opgelost door sequentiebepaling polyacrylamide gelelektroforese (PAGE). Zowel de intensiteit van de DNA-banden en de lengte van de DNA ladder weerspiegelen de hoeveelheid actief enzym moleculen en hun processivity respectievelijk 10.
Dit traditionele test houdt een aantal grote problemen: Het gevaar van blootstelling aan radioactieve stoffen, grote en moeilijk te sequencing PAGE en de tijd het verbruik van de gel lopen en blootstelling van het radioactieve product film verwerken ('s nachts in beide gevallen). </p>
Dit protocol biedt een verbeterde niet-radioactieve agarose mini-gel gebaseerde bepaling. De DNA 6 bp ladder wordt opgelost met 4,5% hoge-resolutie agarose gel en de detectie wordt bereikt met zeer gevoelige nucleïnezuur vlek. De combinatie van het gebruik van hoge resolutie agarose mini-gel en gevoelige nucleïnezuur kleuring biedt eenvoudig te hanteren assay, wordt voorkomen van blootstelling aan radioactiviteit en aanzienlijk verkort overall duration assay van 3 dagen tot enkele uren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse van telomerase-activiteit in de hersenen van muizen via de TRAP assay bestaat uit 4 belangrijke stappen: 1) proteïnen extractie uit specifieke gebieden van het hersenweefsel 2) TS primerverlenging door telomerase – telomerase reactie 3) amplificatie van het telomerase reactieproducten door PCR 4 ) scheiding van de PCR producten met behulp van hoge resolutie agarose gel.
Deze gemodificeerde TRAP assay worden twee belangrijke problemen die ontstaan uit de traditionele assay: het…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
Referencias
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
