マウス脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性：非放射性テロメラーゼリピート増幅プロトコル（TRAP）アッセイ
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
テロメラーゼ、リボ核タンパク質は、テロメアの長さを維持し、したがって、ゲノムの完全性、増殖および寿命を促進するための責任があります。さらに、テロメラーゼは、酸化ストレスからミトコンドリアを保護し、そのようなニューロンのような非有糸分裂活性の高い細胞の生存のために重要である可能性を示唆し、アポトーシスに対する耐性を付与する。私たちは、以前にさまざまなマウスの脳領域におけるテロメラーゼ活性および発現を増加させ、酸化ストレスからの運動ニューロンの細胞を保護する新規なテロメラーゼ活性剤の能力を実証した。これらの結果は、テロメラーゼは、さまざまな病変からのニューロンの保護に関与しているという考えを強化する。脳内のテロメラーゼの役割を強調するために、ここでは男性と女性のマウス脳におけるテロメラーゼの活性、年齢への依存を比較します。 TRAPアッセイは、さまざまな組織または細胞株においてテロメラーゼ活性を検出するための標準的な方法である。ここでは、ANALYを実証標準的なTRAPアッセイの改変が続くCHAPS溶解緩衝液を用いてタンパク質抽出を非変性によるマウス脳の三つの領域におけるテロメラーゼ活性のSIS。
この2工程アッセイでは、内因性テロメラーゼはTTAGGG 6 bpの反復（テロメラーゼ反応）を添加することにより、特定のテロメラーゼ基質（TSプライマー）を伸長する。テロメラーゼ反応生成物は、6 bpの増分のDNAラダーを作成するPCR反応により増幅される。 DNAラダーの分析は、高感度の核酸染色で染色し、続いて4.5％高分解能アガロースゲル電気泳動によって行われる。
32 Pは、DNAの検出およびDNAラダーを解決するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動のために放射性のdCTPのラベル付け活用する従来のTRAPアッセイと比較すると、このプロトコルは、マウス脳におけるテロメラーゼ活性を評価する能力を実証するためのTRAPアッセイを節約非毒性時間を提供telomerasの相違を検出さまざまな雌雄マウスの脳領域での電子の活動。
Introduction
テロメラーゼは、テロメラーゼからなるリボ核タンパク質逆転写酵素（TERT）、テロメラーゼの触媒サブユニット、およびRNA成分（TERC）である。テロメラーゼの標準的な役割は、ゲノムの完全性を促進するため、テロメア末端に反復配列（TTAGGG）を添加することによりテロメアの適切な長さを維持することであり、細胞増殖1。それはさまざまな損傷剤2により誘導されるアポトーシスに対する耐性を付与する、つまり追加の役割は、細胞内でTERTに起因した、酸化的ストレス3からのヒト間葉系幹細胞を保護し、肯定的なRNAをTIA1するその協会が完全に分化したニューロンにおける生存促進の役割を果たしている顆粒4。
酵素発現および活性レベルは緊密に非分裂細胞5,6で規制されている間TERTは、分裂細胞および癌のほとんどの種類の中で、主に体細胞で発現され、アクティブにされている。研究は、rの中でそれを示しているTERT mRNAが成人期7に低いレベルに維持しながらodent脳は、テロメラーゼ活性は、生後10日目では検出不可能になる。他の研究では、成人のサブ脳室帯、嗅球、海馬内のテロメラーゼ活性を示し、そして大人の小脳および皮質8。 、注射したマウスSOD1トランスジェニックにおける筋萎縮性側索硬化症の発症および進行を遅延 – 私たちは、最近、脳および脊髄におけるテロメラーゼ発現および活性を増加させる新規化合物は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）における神経保護効果を発揮することを実証マウスおよびこれらのマウス9の脊髄における運動ニューロンの生存を増加させた。完全ニューロンおよび脳におけるテロメラーゼの生存促進の役割を理解するためには、脳のさまざまな領域におけるテロメラーゼ活性の検出のための単純かつ比較的敏感な高速アッセイを開発することが不可欠である。
テロメアREPEAT増幅プロトコール（TRAP）は、テロメラーゼの標準的な活性とポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を組み合わせるよく知られた高感度のアッセイである。このアッセイでは、テロメラーゼはTTAGGGがテロメラーゼ基質へのTSリバースプライマー用いて6塩基対（bp）のDNAラダー生成するPCR増幅に続いて（TSプライマー）、オリゴヌクレオチド、繰り返さ付加する。 – ACXを32 P標識dCTPを者が検出するために使用されるPCR産物の量が少ない。 DNAラダーは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を配列決定することにより解決される。どちらのDNAバンドの強度とDNAラダーの長さは、活性酵素分子の量とその処理能力はそれぞれ10を反 映している。
この伝統的なアッセイは、いくつかの主要な難しさを保持します（一晩どちらの場合も）シーケンシングPAGEおよびゲル走行時の消費量と放射性製品のフィルム露光を処理するために大規模なハード放射性物質への暴露の危険性。 </p>
このプロトコルは、改良された非放射性アガロースミニゲルに基づくアッセイを提供しています。 DNA 6 bpラダーは4.5％高分解能アガロースゲルを用いて解決され、検出は高感度の核酸染色を用いて達成される。高分解能アガロースミニゲルを用いて、敏感な核酸染色アッセイを扱うことは容易提供の組み合わせは、放射能への暴露の危険性を排除し、大幅に数時間から3日全体のアッセイ時間を短縮する。
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAPアッセイを介したマウスの脳内のテロメラーゼ活性の分析4の手順で構成されます。脳組織2の特定の領域からの1）タンパク質抽出）テロメラーゼによるTSプライマー伸長 – PCR法4によるテロメラーゼ反応生成物のテロメラーゼ反応3）増幅高分解能アガロースゲルを用いてPCR産物を）分離する。
敏感なPCR産物の検出とDNAラダーのPAGE分離のためのdCTP年代放射性の使用：?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
Referencias
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