La telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
Telomerasi, un ribonucleoproteina, è responsabile del mantenimento della lunghezza dei telomeri e quindi promuovere l'integrità genomica, la proliferazione, e la durata della vita. Inoltre, la telomerasi protegge i mitocondri dallo stress ossidativo e conferisce resistenza all'apoptosi, suggerendo la sua possibile importanza per la sopravvivenza dei non-mitotico, cellule altamente attive come i neuroni. Abbiamo precedentemente dimostrato la capacità di attivatori telomerasi nuovi per aumentare l'attività della telomerasi e di espressione nelle varie regioni del cervello del mouse e per proteggere le cellule neuroni motori dallo stress ossidativo. Questi risultati rafforzano l'idea che la telomerasi è coinvolto nella protezione dei neuroni da varie lesioni. Per sottolineare il ruolo della telomerasi nel cervello, noi qui a confronto l'attività della telomerasi nel cervello maschile e femminile del mouse e la sua dipendenza dell'età. TRAP assay è un metodo standard per la rilevazione dell'attività della telomerasi in vari tessuti o linee cellulari. Qui mostriamo il Analysis di attività della telomerasi nelle tre regioni del cervello di topo da parte di non-denaturazione estrazione delle proteine usando CHAPS Lysis Buffer seguita dalla modifica del dosaggio TRAP standard.
In questo test 2-step, telomerasi allunga un substrato endogeno telomerasi specifico (TS primer) con l'aggiunta di TTAGGG 6 ripetizioni bp (reazione telomerasi). I prodotti di reazione telomerasi sono amplificati dalla reazione di PCR creando una scala di DNA di incrementi di 6 bp. L'analisi del DNA ladder è fatto da alta risoluzione elettroforesi su gel di agarosio 4,5% seguita da colorazione con colorante altamente sensibile acido nucleico.
Rispetto al tradizionale test TRAP che utilizzano 32 P etichettato radioattivo dCTP di per il rilevamento del DNA e di elettroforesi su gel di poliacrilamide per risolvere la scala del DNA, questo protocollo offre un risparmio di saggio TRAP per valutare l'attività della telomerasi nel cervello di topo, dimostrando la capacità di tempo non tossico rilevare le differenze di telomerase l'attività nei vari regione del cervello di topo femmina e maschio.
Introduction
La telomerasi è un ribonucleoproteina composto di telomerasi trascrittasi inversa (TERT), la subunità catalitica della telomerasi, e una componente RNA (TERC). Il ruolo canonico di telomerasi è quello di preservare la corretta lunghezza dei telomeri con l'aggiunta di sequenze ripetitive (TTAGGG) alle estremità telomeriche, promuovendo quindi l'integrità genomica, e la proliferazione delle cellule 1. Ruoli supplementari sono stati attribuiti al TERT nelle cellule, vale a dire che conferisce resistenza all'apoptosi indotta da vari agenti dannosi 2, protegge le cellule staminali mesenchimali umane da stress ossidativo 3, e svolge un ruolo pro-sopravvivenza nei neuroni completamente differenziati dalla sua associazione di TIA1 RNA positivo granuli 4.
TERT è espresso e attivo soprattutto nelle cellule somatiche dividendo e nella maggior parte dei tipi di tumori, mentre i livelli di espressione e l'attività enzimatica sono strettamente regolati in cellule non-dividendo 5,6. Studi hanno dimostrato che nel rcervello Odent, l'attività della telomerasi diventa inosservabile da giorno postnatale 10, mentre TERT mRNA viene mantenuta a livelli inferiori in età adulta 7. Altri studi hanno dimostrato l'attività della telomerasi nella zona sub-ventricolare adulto, il bulbo olfattivo, l'ippocampo, e nel cervelletto e nella corteccia adulta 8. Abbiamo recentemente dimostrato che nuovi composti che aumentano l'espressione e l'attività della telomerasi nelle corde cerebrali e spinali hanno esercitato effetti neuroprotettivi in N-metil-D-aspartato (NMDA) – topi iniettati, ritardato l'insorgenza e la progressione della malattia sclerosi laterale amiotrofica in SOD1 transgenici topi e ha aumentato la sopravvivenza dei neuroni motori nel midollo spinale di questi topi 9. Per comprendere appieno il ruolo pro-sopravvivenza della telomerasi nei neuroni e nel cervello, è necessario sviluppare un test semplice e relativamente veloce sensibile per la rilevazione dell'attività della telomerasi nelle varie regioni del cervello.
Il telomerica rprotocollo di amplificazione EPEAT (TRAP) è un noto test sensibile che unisce l'attività canonica della telomerasi e la reazione a catena della polimerasi (PCR). In questo saggio, la telomerasi aggiunge TTAGGG ripete ad un substrato telomerasi (TS primer) oligonucleotide, seguita da amplificazione PCR che genera 6 coppie di basi (bp) scala del DNA utilizzando il TS inverso fondo -. ACX 32 P etichettato dCTP di sono utilizzati per rilevare la bassa quantità di prodotti di PCR. La scala di DNA viene risolto mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide sequenziamento (PAG). Sia l'intensità delle bande di DNA e la lunghezza del DNA ladder riflettono la quantità di molecole di enzima attivo e la loro processività rispettivamente 10.
Questo test tradizionale contiene alcune importanti difficoltà: Il pericolo di esposizione a sostanze radioattive, grandi e difficili da gestire sequenziamento PAGE e il consumo di tempo del gel corsa e l'esposizione pellicola del prodotto radioattivo (pernottamento in entrambi i casi). </p>
Questo protocollo offre un miglioramento non radioattivo agarosio saggio basato mini-gel. Il DNA 6 bp ladder viene risolto utilizzando 4,5% ad alta risoluzione su gel di agarosio e l'individuazione ha luogo con colorazione molto sensibile acido nucleico. La combinazione di alta risoluzione usando agarosio mini-gel e macchia sensibile acido nucleico offre maneggevole dosaggio, elimina il rischio di esposizione alla radioattività e abbreviare notevolmente la durata complessiva dosaggio da 3 giorni a diverse ore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analisi delle attività della telomerasi nel cervello di topo mediante il dosaggio TRAP composto da 4 fasi principali: 1) proteine estrazione dalle regioni specifiche del tessuto cerebrale 2) TS allungamento fondo da telomerasi – reazione telomerasi 3) amplificazione dei prodotti di reazione telomerasi mediante PCR 4 ) separazione dei prodotti PCR utilizzando alta risoluzione gel di agarosio.
Questo saggio TRAP modificato affronta due principali difficoltà che si innalzano dal test tr…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
Referencias
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- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
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