Активности теломеразы в различных регионах мозга мыши: нерадиоактивный теломеразы повторить Amplification протокол (TRAP) Анализ
Summary
Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.
Abstract
Теломераза, рибонуклеопротеиновый, отвечает за поддержание длину теломер и, следовательно, содействие геномной целостности, пролиферацию, и продолжительность жизни. Кроме того, теломераза защищает митохондрии от окислительного стресса и придает устойчивость к апоптозу, предлагая свое возможное значение для выживания не-митотических, высокоактивные клетки, такие как нейроны. Мы ранее продемонстрировали способность новых теломеразы активаторов для увеличения активности теломеразы и выражение в различных регионах мозга мыши и защищать моторных нейронов клетки от окислительного стресса. Эти результаты укрепляют мнение, что теломераза участвует в защите нейронов от различных повреждений. Чтобы подчеркнуть роль теломеразы в мозге, мы здесь сравнивать активность теломеразы в мужской и женский мозг мыши и ее зависимость от возраста. TRAP анализа является стандартным методом для обнаружения активности теломеразы в различных тканях или клеточных линий. Здесь мы показываем, анализа парамSIS теломеразной активности в трех областях головного мозга мыши путем неденатурирующих экстрагирования белка с использованием буфера для лизиса CHAPS затем модификации стандартного TRAP анализа.
В этом 2-ступенчатой анализа, эндогенный теломеразы удлиняет конкретный теломеразы субстрат (TS праймера) добавив TTAGGG 6 повторов, BP (теломеразы реакцию). Реакционные теломераза продукты усиливаются с помощью ПЦР-реакции, создающей ДНК лестнице 6 шагом ВР. Анализ ДНК маркера производится с помощью электрофореза в агарозном геле 4,5% высокого разрешения с последующим окрашиванием красителем высокочувствительного нуклеиновой кислоты.
По сравнению с традиционным TRAP анализа, которые используют 32 P с надписью радиоактивных дЦТФ для выявления ДНК и электрофореза в полиакриламидном геле для решения лестницу ДНК, этот протокол предлагает нетоксичный экономия времени TRAP анализа для оценки активности теломеразы в мозге мыши, демонстрируя способность к выявления различий в telomerasэ деятельность в различных женского и мужского области мозга мыши.
Introduction
Теломеразы является рибонуклеопротеин состоит из теломеразной обратной транскриптазы (TERT), каталитической субъединицы теломеразы, и компонент РНК (TERC). Каноническая роль теломеразы является сохранение надлежащего длину теломер, добавив повторяющиеся последовательности (TTAGGG) к теломерными концов, поэтому содействие геномной целостности и пролиферацию клеток 1. Дополнительные роли были отнесены к трет в клетках, то есть придает устойчивость к апоптозу, вызванному различными повреждающего агента 2, защищает человека мезенхимальные стволовые клетки от окислительного стресса 3, и играет роль про-выживания в полностью дифференцированных нейронов своей причастностью к TIA1 положительный РНК гранулы 4.
TERT выражается и активны в основном в соматических деления клеток и в большинстве видов рака, в то время как уровни экспрессии фермента и активность жестко регулируется в не-деления клеток 5,6. Исследования показали, что в рОден мозга, активность теломеразы более не обнаруживается день после рождения 10, в то время как ТРЕТ мРНК поддерживается на более низких уровнях и во взрослом возрасте 7. Другие исследования показали, активность теломеразы в рамках суб-желудочковой зоны взрослого, обонятельной луковице, гиппокампе, и во взрослом мозжечке и коре 8. Мы недавно показали, что новые соединения, которые повышают экспрессию теломеразы и активность в мозге и спинном мозге, оказываемое нейропротекторное действие в N-метил-D-аспартат (NMDA) – вводили мышам, задержка развития и прогрессирования о боковой амиотрофический склероз болезни в СОД1 трансгенных мышей и повышает выживаемость моторных нейронов в спинном мозге этих мышей 9. Чтобы полностью понять роль про-выживания теломеразы в нейронах и в мозге, важно разработать простой и относительно чувствительной быстрый тест для обнаружения активности теломеразы в различных областях головного мозга.
Теломерный гПротокол EPEAT амплификации (TRAP) представляет собой хорошо известный чувствительным анализом сочетания канонический активность теломеразы и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В этом анализе, теломераза добавляет TTAGGG повторяет в теломеразы подложки (TS грунтовку) олигонуклеотида, а затем с помощью ПЦР-амплификации, который генерирует 6 пар оснований (АД) ДНК лестнице, используя TS обратного праймера -. ACX 32 P помечены дЦТФ, используются для обнаружения низкое количество продуктов ПЦР. Лестница ДНК решается секвенирование полиакриламидном геле (ПААГ). И интенсивность полос ДНК и длина лестницы ДНК отражают количество активных молекул фермента и их процессивности соответственно 10.
Этот традиционный анализ имеет некоторые серьезные трудности: опасность воздействия на радиоактивных веществ, больших и твердых обрабатывать секвенирования страницы и время потребление работающем гель и пленки воздействия радиоактивного продукта (в течение ночи в обоих случаях). </p>
Этот протокол предлагает улучшенный нерадиоактивный агарозном мини-гель анализа, основанный. ДНК 6 б.п. лестница будет решена с помощью 4,5% с высоким разрешением агарозном геле и обнаружение достигается с помощью высокочувствительного пятно нуклеиновой кислоты. Сочетание высокого разрешения с использованием агарозы мини-гель и чувствительный краситель нуклеиновой кислоты предлагает простой в обращении анализа, исключает опасность воздействия радиоактивности и значительно сократить общую продолжительность анализа от 3 дней до нескольких часов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ активности теломеразы в мозге мыши через ловушку анализа состоит из 4 основных этапа: 1) белков извлечения из конкретных регионов мозговой ткани 2) ИР удлинение праймера по теломеразы – теломераза реакции 3) усиления реакции теломераза продуктов с помощью ПЦР 4 ) разделение продукт…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by B.G. Negev technology and Linda Powers’s contribution.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TRAP Mix (X10) | Made manually, mix the following in UPW: 630mM KCl, 200mM Tris-HCl pH8.2, 10mM EDTA, 15mM MgCl2, 1mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from sigma). Aliquots are freezed in -20 C. | ||
| Ringer's solution | Made manually, mix the following in DDW: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.25mM NaH2PO4*H2O, 2mM MgSO4, 26mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Handle with care in a chemical hood |
| dNTP's 10 mM | Sigma | D7295 | |
| TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| Titanium Taq Polymerase/Buffer | Clontech | S1792/S1793 | |
| High Resolution agarose | Sigma | A4718 | Any high quality high-resolution agarose may be sutible |
| Mini-gel apparatus | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nucleic-acid Stain (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration | |
| CHAPS lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9852S | Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1mM |
| Ultra Pure Water (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 mice | HARLAN Laboratories INC. |
Referencias
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602 (2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
