الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان
Summary
A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.
Abstract
High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.
Introduction
للتطبيقات العلاجية الجين هو من أهمية كبيرة لتجنب الآثار الجانبية السامة للخلايا المناعية والناجمة عن التعبير عن البروتينات الفيروسية، والتحوير نفسه أو من البروتينات الفيروسية واردة. وتستخدم على نطاق واسع ناقلات اتش (ADV) لإدخال DNA الأجانب إلى مجموعة واسعة من الخلايا للتحقيق في تأثير التعبير التحوير 1،2. ويمثل النسخة الأكثر تقدما من ADV بواسطة ناقلات اتش قدرة عالية (HCAdV) تفتقر إلى كل تسلسل الترميز الفيروسية 3،4 وبالتالي يوفر سعة التعبئة والتغليف تصل إلى 35 كيلو بايت جنبا إلى جنب مع انخفاض المناعة وانخفاض السمية 5-8. ونظرا لقدرة عالية عبواتها أنها تسمح إيصال الجينات المحورة كبيرة أو متعددة باستخدام جرعة ناقلات واحدة. وبالتالي، فإنها تمثل أداة قيمة لمجتمع البحث.
وعلى النقيض من الأولى أو الجيل الثاني من ADV تفتقر إلى الجينات الأولى E1 و / أو E3 التي يمكن إنتاجها بسهولة باستخدام مجموعات تجارية، مركزناتور بناء جينوم الفيروس وإنتاج HCAdV أكثر تعقيدا. ويستند هذا النظام لبناء الجينوم HCAdV على pAdFTC البلازميد يحمل الجينوم HCAdV خال من كل تسلسل الترميز الفيروسية والبلازميد المكوك pHM5 12/09. يمكن استنساخ أي جين من فائدة تصل إلى 14 كيلو قواعد (كيلوبايت) في pHM5 ناقلات المكوك الذي يحيط موقع استنساخ متعددة من خلال الاعتراف / الشق المواقع من endonucleases صاروخ موجه PI- SCE الأول وI- سيو I. ولذلك، فإن الجينات المستنسخة من الفائدة يمكن أن تنطلق من PI- التوالي SCE الأول وI- سيو I يساعد على هضم للالإدراج الموجهة لاحق في نفس المواقع قيود الموجودة في الجينوم HCAdV الواردة في pAdFTC البلازميد. في pAdFTC ويحيط الموقع التحوير الإدراج تقع بين PI- SCE الأول وI- سيو I انشقاق المواقع عن طريق ستوفير DNA وتسلسل الفيروسة الغدانية غير المكودة اللازمة لتغليف الجينوم تلك يكرر الطرفية كما 5 'و 3' مقلوب (وائح الاتصالات الدولية)عند كلا الطرفين وإشارة التعبئة والتغليف المصب من 5'ITR. يوفر DNA ستوفير إضافي الحجم الأمثل للجينوم HCAdV النهائي تتراوح 27-36 كيلوبايت التعبئة والتغليف لضمان كفاءة خلال إنتاج الفيروس. منذ pAdFTC هو البلازميد كبير مع ما يصل إلى 45 كيلو بايت (تعتمد على حجم التحوير إدخالها) واستخدام endonucleases صاروخ موجه مع المواقع الاعتراف DNA طويلة مماثل في المعارض DNA قوية ملزمة، هي عدة خطوات تنظيف اللازمة أثناء نقل التحوير من pHM5 لpAdFTC. ويوصى معالجة متأنية تجنب قوى القص.
ويحيط وائح الاتصالات الدولية من الجينوم HCAdV بواسطة Not I انزيم تقييد المواقع الاعتراف يقع مباشرة من المنبع والمصب 5'ITR من 3'ITR 12. ولذلك، HCAdV يمكن أن تنطلق من ليس أنا هضم لترنسفكأيشن لاحق من الجينوم الفيروسي في خط الخلية المنتجة HCAdV. لاحظ أن استخدام انزيم التقييد ليس أنا ليختلطسهولة الجينوم الفيروسي من pAdFTC البلازميد يعني أن التحوير إدراج يخلو من المواقع الاعتراف ليس أنا DNA. الخلايا المنتجة خلية HEK293 أساس (116 الخلايا) التعبير عن مستقر لجنة المساواة العرقية recombinase. لتضخيم فيروس يشترك في إصابة-116 الخلايا مع فيروس المساعد (HV) توفير جميع الجينات ADV حاجة لتكرارها والتعبئة والتغليف في غير المشبعة 3،4. وHV هو الجيل الأول ADV مع إشارة التعبئة floxed التي يتم إزالتها خلال تضخيم الفيروس عن طريق لجنة المساواة العرقية recombinase أعرب في 116 الخلايا 4. هذا يضمن أن الجينوم في الغالب HCAdV تحتوي على إشارة التعبئة والتغليف سليمة وencapsidated.
يتم تنفيذ ما قبل التضخيم للHCAdV عن طريق إجراء الخطوات الركض المسلسل في 116 الخلايا المزروعة على الأسطح في أطباق زراعة الأنسجة. بعد كل مرور يتم الافراج الجسيمات الفيروسية من الخلايا المصابة عن طريق إجراء ثلاث خطوات تجميد أذاب متتالية. مع كل مرور أعداد متزايدة من الخلايا المصابة1/3 من المحللة خلية من مرور السابق. أخيرا المحللة من يستخدم الخطوة ما قبل الأخيرة لتضخيم تصيب الخلايا المنتجة تزرع في تعليق في قارورة الدوار لتضخيم نطاق واسع. يتم تنقيته Virions من الخلايا التعليق من أداء تنبيذ فائق في السيزيوم كلوريد التدرج الكثافة 4،12. مع هذا الإجراء يتم فصل الجزيئات والجسيمات فارغة تجميعها بشكل كامل إلى شريطين متميزة. لزيادة تركيز الجسيمات HCAdV يتم تنفيذ خطوة تنبيذ فائق غير تدريجية الثانية. وفي وقت لاحق مما أدى الفرقة التي تحتوي على HCAdV يتم جمعها ومدال ضد عازلة الفسيولوجية. تتميز الاستعدادات ناقلات النهائية فيما يتعلق أعداد الجسيمات الفيروسية المطلقة، والجسيمات المعدية ومستويات التلوث HV. يمكن تحديد الجزيئات الفيروسية المطلقة من قبل الناشر الجسيمات الفيروسية وقياس الامتصاصية في 260 نانومتر أو عن طريق أداء الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) 12. العدوى من بوريمكن تحديد ified جزيئات الفيروس عن طريق QPCR قياس الجينوم HCAdV موجودة داخل الخلايا المصابة 3 ساعة بعد العدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يسمح تنقية ناقلات HCAdV على أساس نوع اتش 5 البشري على أساس الإجراءات الموضحة سابقا 4،12. الجينوم HCAdV داخل البلازميد pAdFTC يخلو من كل الجينات اتش ويحمل 5'- و3'- وائح الاتصالات الدولية وإشارة التعبئة والتغليف فقط. في هذه الاستراتيجية HV AdNG163R-2 4</…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kröner-Fresenius foundation (EKFS).
Materials
| I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | restriction digest |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restriction digest |
| T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | ligation |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | restriction digest |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | restriction digest |
| Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | dephosphorylation of digested plasmids |
| Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | selection of CRE expressing 116 cells |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T cell culture medium |
| Minimal Essential Medium (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 cell culture medium |
| Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | washing of cells, resuspension of cells |
| 250 ml storage bottle | Sigma | CLS430281-24EA | infection of 116 cells grown in suspension |
| 500mL PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentation of cells from suspension culture |
| Spinner flask | Bellco | 1965-61030 | growth of 116 cells in suspension |
| Ultra Clear Ultracentrifuge tubes | Beckmann Coulter | 344059 | density gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| SW-41 rotor | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | dialysis tubing |
| ready-to-use dialysis cassettes | Thermo | 66383 | dialysis |
| one shot DH10B electrocompetent E. coli | invitrogen | C4040-52 | transformation of ligation reactions |
| PureYield™ Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
| peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | isolation of genomic DNA |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | tranfection of 116 cells |
| opti MEM (10 % FBS) | Gibco | 31985-062 | transfection of 116 cells |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | Biorad | qPCR machine | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carl Roth | A156.1 | purification of DNA |
| Cesium chloride | Carl Roth | 8627.1 | density gradient centrifugation |
| sodium acetate 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA precipitation |
| LB medium | Carl Roth | X968.3 | bakterial growth medium |
| ethanol 99,8% pure | Carl Roth | 9065.5 | DNA precipitation and washing |
| SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lysis buffer |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lysis buffer |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | dialysis buffer/ lysis buffer |
| glycerol 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | dialysis buffer |
| MgCl2 98,5% | Carl Roth | KK36.2 | dialysis buffer |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | optional dialysis buffer |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | optional dialysis buffer |
| sucrose | Carl Roth | 9286.1 | optional dialysis buffer |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | optional dialysis buffer |
| 1,5ml tubes | sarstedt | 72,730,005 | storage of virus preparations at -80°C |
Referencias
- Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
- Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).
- Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).
- Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).
- Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).
- Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).
- Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).
- Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).
- Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, (2001).
