La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5
Summary
A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.
Abstract
High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.
Introduction
Para aplicaciones terapéuticas de genes es de gran importancia para evitar efectos secundarios citotóxicos e inmunogénicas causadas por la expresión de proteínas virales, el propio transgén o por las proteínas virales entrantes. Los vectores de adenovirus (ADV) se utilizan ampliamente para introducir ADN extraño en una amplia variedad de células para investigar el impacto de la expresión transgénica 1,2. La versión más avanzada de AdV está representado por los vectores de adenovirus de alta capacidad (HCAdV) que carecen de todas las secuencias de codificación virales 3,4 y ofreciendo con ello una capacidad de envasado de hasta 35 kb combinados con baja inmunogenicidad y baja toxicidad 5-8. Debido a su alta capacidad de envasado que permiten la entrega de grandes o múltiples transgenes utilizando una dosis única vector. Por lo tanto, representan una herramienta valiosa para la comunidad de investigación.
En contraste con el primer o segundo AdV generación que carece de los genes tempranos E1 y / o E3 que se pueden producir fácilmente usando kits comerciales, vector producción de la construcción del genoma y virus de HCAdV es más compleja. El sistema para la construcción de genomas HCAdV se basa en la pAdFTC plásmido que lleva un genoma HCAdV desprovisto de todas las secuencias de codificación virales y el plásmido lanzadera pHM5 9-12. Cualquier gen de interés de hasta 14 bases kilo (kb) se puede clonar en el pHM5 vector lanzadera en la que el sitio de clonación múltiple está flanqueada por el reconocimiento / sitios de las endonucleasas de la vivienda escindir PI Sce I y I-Ceu I. Por lo tanto, un gen clonado de interés puede ser liberado por PI- Sce I y consecutiva I- Ceu I digiere para la inserción dirigida posterior en los mismos sitios de restricción presentes en el genoma HCAdV contenida en el plásmido pAdFTC. En pAdFTC el sitio de inserción del transgén situado entre el PI- Sce I y I-Ceu I división sitios está flanqueado por ADN de relleno y las secuencias no codificantes adenovirales requeridos para el envasado del genoma tales como repeticiones terminales 5 'y 3' invertida (ITR)en ambos extremos y la señal de empaquetamiento aguas abajo de la 5'ITR. El ADN de relleno adicional proporciona tamaño óptimo del genoma HCAdV final en un intervalo de 27 a 36 kb para asegurar el empaquetamiento eficaz durante la producción de virus. Desde pAdFTC es un plásmido grande con hasta 45 kb (dependiente del tamaño del transgén insertado) y el uso de endonucleasas de la vivienda con los sitios de reconocimiento de ADN largas comparativamente exhibe una fuerte unión a ADN, varios pasos de limpieza son necesarios durante la transferencia del transgén de pHM5 a pAdFTC. Se recomienda un manejo cuidadoso evitando fuerzas de cizallamiento.
Las ITR del genoma HCAdV están flanqueadas por No me sitios de reconocimiento de enzimas de restricción localizados directamente arriba de la 5'ITR y aguas abajo del 3'ITR 12. Por lo tanto, HCAdV puede ser puesto en libertad por no digiero para la posterior transfección del genoma viral en la línea celular productora HCAdV. Tenga en cuenta que el uso de la enzima de restricción Not I para relfacilidad del genoma viral de la pAdFTC plásmido implica que el transgén insertado carece de sitios de reconocimiento Not I de ADN. Las células productoras basadas en células HEK293 (116 células) expresan de forma estable la recombinasa Cre. Para la amplificación del virus 116 células están coinfectados con un virus auxiliar (HV) proporcionar todos los genes AdV necesarias para la replicación y el embalaje en trans 3,4. El HV es un AdV primera generación con una señal de embalaje floxed que se elimina durante la amplificación del virus por la recombinasa Cre expresada en células 116 4. Esto asegura que los genomas predominantemente HCAdV contienen una señal de embalaje intacto se encapsidados.
Pre-amplificación de la HCAdV se lleva a cabo mediante la realización de pasos pases seriados en 116 células cultivadas en superficies en placas de cultivo de tejidos. Después de cada paso de partículas víricas se liberan de las células infectadas mediante la realización de tres pasos de congelación-descongelación consecutivas. Con cada paso de un número creciente de células se infectan con1/3 del lisado celular del paso anterior. Finalmente lisado procedente se utiliza el último paso de pre-amplificación para infectar células productoras se cultivan en suspensión en un matraz de agitación para la amplificación a gran escala. Los viriones se purificaron a partir de las células en suspensión mediante la realización de ultracentrifugación en un gradiente de densidad de cloruro de cesio 4,12. Con este procedimiento las partículas vacías y las partículas totalmente ensamblados se separan en dos bandas distintas. Para concentrar aún más el HCAdV partículas se lleva a cabo una segunda etapa de ultracentrifugación no gradual. Posteriormente se recoge la banda resultante que contiene el HCAdV y se dializa frente a un tampón fisiológico. Preparaciones de vector final se caracterizan con respecto a los números absolutos de partículas virales, partículas infecciosas y los niveles de contaminación HV. Partículas virales absolutos pueden ser determinados mediante la lisis de las partículas virales y midiendo la absorbancia a 260 nm o mediante la realización cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) 12. La infectividad del purpartículas de virus ficados pueden ser determinados por los genomas de medición HCAdV qPCR presentes dentro de las células infectadas 3 hr después de la infección.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo que aquí se presenta permite la purificación de los vectores basados en adenovirus HCAdV tipo humano 5 basado en procedimientos descritos previamente 4,12. El genoma HCAdV dentro del plásmido pAdFTC está desprovisto de todos los genes de adenovirus y sólo lleva a los 5 'y 3'-RTI y la señal de empaquetamiento. En esta estrategia, el HV AdNG163R-2 4 proporciona todos los genes necesarios para la producción de virus eficiente en trans. Esto ofrece una capacid…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kröner-Fresenius foundation (EKFS).
Materials
| I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | restriction digest |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restriction digest |
| T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | ligation |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | restriction digest |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | restriction digest |
| Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | dephosphorylation of digested plasmids |
| Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | selection of CRE expressing 116 cells |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T cell culture medium |
| Minimal Essential Medium (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 cell culture medium |
| Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | washing of cells, resuspension of cells |
| 250 ml storage bottle | Sigma | CLS430281-24EA | infection of 116 cells grown in suspension |
| 500mL PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentation of cells from suspension culture |
| Spinner flask | Bellco | 1965-61030 | growth of 116 cells in suspension |
| Ultra Clear Ultracentrifuge tubes | Beckmann Coulter | 344059 | density gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| SW-41 rotor | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | dialysis tubing |
| ready-to-use dialysis cassettes | Thermo | 66383 | dialysis |
| one shot DH10B electrocompetent E. coli | invitrogen | C4040-52 | transformation of ligation reactions |
| PureYield™ Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
| peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | isolation of genomic DNA |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | tranfection of 116 cells |
| opti MEM (10 % FBS) | Gibco | 31985-062 | transfection of 116 cells |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | Biorad | qPCR machine | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carl Roth | A156.1 | purification of DNA |
| Cesium chloride | Carl Roth | 8627.1 | density gradient centrifugation |
| sodium acetate 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA precipitation |
| LB medium | Carl Roth | X968.3 | bakterial growth medium |
| ethanol 99,8% pure | Carl Roth | 9065.5 | DNA precipitation and washing |
| SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lysis buffer |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lysis buffer |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | dialysis buffer/ lysis buffer |
| glycerol 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | dialysis buffer |
| MgCl2 98,5% | Carl Roth | KK36.2 | dialysis buffer |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | optional dialysis buffer |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | optional dialysis buffer |
| sucrose | Carl Roth | 9286.1 | optional dialysis buffer |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | optional dialysis buffer |
| 1,5ml tubes | sarstedt | 72,730,005 | storage of virus preparations at -80°C |
Referencias
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