ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5
Summary
A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.
Abstract
High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.
Introduction
עבור יישומים טיפוליים גן זה הוא בעל חשיבות רבה, כדי למנוע תופעות לוואי רעילות לתאים וחיסוניים הנגרמות על ידי ביטוי של חלבונים נגיפיים, transgene עצמו או על ידי חלבונים נגיפיים נכנסים. וקטורי אדנווירוס (עו"ד) נמצאים בשימוש נרחב כדי להציג דנ"א זר לתוך מגוון רחב של תאים כדי לחקור את ההשפעה של ביטוי transgene 1,2. הגרסה המתקדמת ביותר של עו"ד מיוצגת על ידי וקטורי קיבולת גבוהה אדנווירוס (HCAdV) חסרים כל רצפי הקידוד הנגיפיים 3,4 ובכך מציע קיבולת אריזה עד 35 קילו בשילוב עם חיסוני נמוכות ונמוכה רעילות 5-8. בשל יכולת האריזה שלהם גבוהה הם מאפשרים משלוח של transgenes הגדול או מרובה באמצעות מינון וקטור יחיד. לכן, הם מייצגים כלי רב ערך עבור קהילת המחקר.
בניגוד לראשון או עו"ד דור השני חסר גנים המוקדמים E1 ו / או E3 שניתן להפיק בקלות באמצעות ערכות מסחריות, vecטור ייצור בניית הגנום ווירוס של HCAdV הוא מורכב יותר. המערכת לבניית הגנום HCAdV מבוססת על פלסמיד שנשא pAdFTC הגנום HCAdV נטול כל רצפי הקידוד הנגיפיים ופלסמיד הסעות pHM5 9-12. כל גן של עניין של עד 14 קילו בסיסים (KB) ניתן לשכפל לpHM5 וקטור הסעות שבאתר השיבוט מרובה מוקף הכרה / ביקוע אתרים של endonucleases ביות PI- SCE אני ואני- Céu I. לכן, גן משובט של עניין ניתן לשחרר על ידי PI- רצוף SCE אני ואני- Céu אני מעכל להכנסה הבאה מופנה לאותם אתרי ההגבלה הנוכחיים בגנום HCAdV הכלול בpAdFTC פלסמיד. בpAdFTC אתר הכנסת transgene ממוקם בין PI- SCE אני ואני- Céu אני מחשוף אתרים מוקף stuffer DNA ורצפי adenoviral noncoding נדרשים לאריזת הגנום כגון חוזר מסוף כ5 'ו 3' הפוכים (ITRS)בשני קצוות ואות האריזה במורד הזרם של 5'ITR. Stuffer DNA נוסף מספק גודל אופטימלי של הגנום HCAdV הסופי הנע 27-36 קילו כדי להבטיח אריזה יעילה בייצור וירוס. מאז pAdFTC הוא פלסמיד גדול עם עד 45 קילו (תלוי בגודל של transgene הוכנס) ואת השימוש של endonucleases ביות עם אתרי הכרה comparably ארוכים DNA מציג DNA החזק מחייב, כמה צעדי ניקוי נחוצים בעת העברה של transgene מpHM5 לpAdFTC. טיפול זהיר הימנעות כוחות הגז מומלץ.
ITRS של הגנום HCAdV נמצא לצד לא אני אתרי הכרת אנזים הגבלה ממוקמים ישירות במעלה הזרם של 5'ITR ומורד זרם של 3'ITR 12. לכן, יכול להיות שפורסם על ידי HCAdV לא אני לעכל לtransfection הבא של הגנום הנגיפי לתוך קו תא מפיק HCAdV. שימו לב שהשימוש באנזים ההגבלה לא אני לrelקלות הגנום הנגיפי מpAdFTC פלסמיד מרמזת כי transgene הוכנס הוא נטול הכרת אתרים לא אני DNA. תאי מפיק תא HEK293 מבוססים (116 תאים) ביציבות להביע recombinase Cre. להגברת וירוס 116 תאים שיתוף נגועים בוירוס עוזר (HV) מספק את כל הגנים עו"ד דרושים לשכפול ואריזה ב3,4 טרנס. HV הוא עו"ד דור ראשון עם אות אריזת floxed אשר הוסרה במהלך ההגברה וירוס על ידי recombinase Cre בא לידי ביטוי בתאים 116 4. הדבר מבטיח כי הגנום בעיקר HCAdV מכיל אות אריזת שלמי encapsidated.
טרום הגברה של HCAdV מתבצעת על ידי ביצוע צעדי passaging סידוריים ב116 תאים גדלו על משטחים במנות בתרבית רקמה. אחרי כל קטע חלקיקים נגיפיים משתחררים מהתאים נגועים על ידי ביצוע שלושה שלבים להקפיא להפשיר ברציפות. עם כל מעבר מספר רב של תאים נגועים ב1/3 של lysate תא מהמעבר הקודם. לבסוף lysate מהשלב טרום ההגברה האחרונה משמש להדביק תאי מפיק גדלו בהשעיה בבקבוק טווה להגברה בקנה מידה גדולה. Virions הם מטוהרים מתאי ההשעיה על ידי ביצוע ultracentrifugation בצפיפות צזיום כלוריד שיפוע 4,12. עם הליך זה חלקיקים ריקים וחלקיקים שנאספו באופן מלא מופרדים לשתי להקות שונות. להתרכז HCAdV נוסף חלקיקי צעד ultracentrifugation הלא הדרגתי שני מבוצע. בהמשך לכך וכתוצאה מהלהקה המכילה את HCAdV נאסף ודיאליזה נגד מאגר פיסיולוגי. הכנות וקטור סופיות מתאפיינות ביחס למספרים של חלקיקים נגיפיים מוחלטים, חלקיקים מזהמים ורמות זיהום HV. חלקיקים נגיפיים מוחלטים יכולים להיקבע על ידי lysing חלקיקים נגיפיים ומדידת הספיגה ב 260 ננומטר או על ידי ביצוע בזמן אמת PCR (qPCR) 12. הדבקה של PURחלקיקי נגיף ified יכולים להיקבע על ידי הגנום HCAdV מדידת qPCR הנוכחי בתוך תאים נגועים לאחר זיהום 3 שעות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר טיהור של וקטורי HCAdV מבוססים על סוג אדנווירוס אדם 5 מבוססים על נהלים שתוארו קודם לכן 4,12. הגנום HCAdV בתוך פלסמיד pAdFTC הוא נטול כל הגנים אדנווירוס ורק נושא את 5'- ו3'- ITRS ואות האריזה. באסטרטגיה זו HV AdNG163R-2 4 מספק את כל הגנים הנחוצים לייצו…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kröner-Fresenius foundation (EKFS).
Materials
| I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | restriction digest |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restriction digest |
| T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | ligation |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | restriction digest |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | restriction digest |
| Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | dephosphorylation of digested plasmids |
| Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | selection of CRE expressing 116 cells |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T cell culture medium |
| Minimal Essential Medium (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 cell culture medium |
| Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | washing of cells, resuspension of cells |
| 250 ml storage bottle | Sigma | CLS430281-24EA | infection of 116 cells grown in suspension |
| 500mL PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentation of cells from suspension culture |
| Spinner flask | Bellco | 1965-61030 | growth of 116 cells in suspension |
| Ultra Clear Ultracentrifuge tubes | Beckmann Coulter | 344059 | density gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| SW-41 rotor | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | dialysis tubing |
| ready-to-use dialysis cassettes | Thermo | 66383 | dialysis |
| one shot DH10B electrocompetent E. coli | invitrogen | C4040-52 | transformation of ligation reactions |
| PureYield™ Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
| peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | isolation of genomic DNA |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | tranfection of 116 cells |
| opti MEM (10 % FBS) | Gibco | 31985-062 | transfection of 116 cells |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | Biorad | qPCR machine | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carl Roth | A156.1 | purification of DNA |
| Cesium chloride | Carl Roth | 8627.1 | density gradient centrifugation |
| sodium acetate 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA precipitation |
| LB medium | Carl Roth | X968.3 | bakterial growth medium |
| ethanol 99,8% pure | Carl Roth | 9065.5 | DNA precipitation and washing |
| SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lysis buffer |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lysis buffer |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | dialysis buffer/ lysis buffer |
| glycerol 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | dialysis buffer |
| MgCl2 98,5% | Carl Roth | KK36.2 | dialysis buffer |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | optional dialysis buffer |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | optional dialysis buffer |
| sucrose | Carl Roth | 9286.1 | optional dialysis buffer |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | optional dialysis buffer |
| 1,5ml tubes | sarstedt | 72,730,005 | storage of virus preparations at -80°C |
Referencias
- Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
- Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).
- Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).
- Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).
- Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).
- Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).
- Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).
- Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).
- Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, (2001).
