La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

Summary

Se presenta un protocolo para la generación de vectores adenovirales de alta capacidad que carecen de todas las secuencias codificantes virales. La clonación de los transgenes contenidos en el genoma del vector se basa en endonucleasas homing. La amplificación del virus en células productoras cultivadas como células adherentes y en suspensión se basa en un virus auxiliar que proporciona genes virales en trans.

Abstract

Los vectores adenovirales de alta capacidad (HCAdV) desprovistos de todas las secuencias codificantes virales representan uno de los vectores de entrega de genes más avanzados debido a su alta capacidad de empaquetamiento (hasta 35 kb), baja inmunogenicidad y baja toxicidad. Sin embargo, para muchos laboratorios, el uso de HCAdV se ve obstaculizado por el complicado procedimiento para la construcción del genoma del vector y la producción del virus. Aquí, se describe un protocolo detallado para la clonación y producción eficiente de HCAdV basado en el plásmido pAdFTC que contiene el genoma de HCAdV. La construcción de los genomas de HCAdV se basa en un sistema de vectores de clonación que utiliza endonucleasas homing (I-CeuI y PI-SceI). Cualquier gen de interés de hasta 14 kb puede ser subclonado en el vector lanzadera pHM5, que contiene un sitio de clonación múltiple flanqueado por I-CeuI y PI-SceI. Después de la liberación mediada por I-CeuI y PI-SceI del transgén del vector lanzadera, el transgén se puede insertar en el vector de clonación de HCAdV pAdFTC. Debido al gran tamaño del plásmido pAdFTC y a los largos sitios de reconocimiento de las enzimas utilizadas asociadas con una fuerte unión al ADN, es necesario un manejo cuidadoso de los fragmentos de clonación. Para la producción de virus, el genoma HCAdV es liberado por NotI digest y transfectado en una línea celular productora basada en HEK293 que expresa de manera estable la recombinasa Cre. Para proporcionar todos los genes adenovirales para la amplificación de adenovirus, se requiere la coinfección con un virus auxiliar que contenga una señal de empaquetamiento flanqueada por sitios loxP. La preamplificación del vector se realiza en células productoras cultivadas en superficies y la amplificación a gran escala del vector se lleva a cabo en matraces giratorios con células productoras cultivadas en suspensión. Para la purificación del virus, se realizan dos pasos de ultracentrifugación basados en gradientes de cloruro de cesio seguidos de diálisis. Aquí se presentan consejos, trucos y atajos desarrollados en los últimos años trabajando con este sistema vectorial HCAdV.

Introduction

Para aplicaciones terapéuticas de genes es de gran importancia para evitar efectos secundarios citotóxicos e inmunogénicas causadas por la expresión de proteínas virales, el propio transgén o por las proteínas virales entrantes. Los vectores de adenovirus (ADV) se utilizan ampliamente para introducir ADN extraño en una amplia variedad de células para investigar el impacto de la expresión transgénica ^1,2. La versión más avanzada de AdV está representado por los vectores de adenovirus de alta capacidad (HCAdV) que carecen de todas las secuencias de codificación virales ^3,4 y ofreciendo con ello una capacidad de envasado de hasta 35 kb combinados c....

Protocol

1. Construcción del recombinante HCAdV Genomas basado en el plásmido pAdFTC

Nota: Todos los plásmidos se han descrito anteriormente ^11,12 y están disponibles a petición. El procedimiento de clonación se muestra esquemáticamente en la Figura 1.

1. Clonar un gen de interés (GOI) incluidos el promotor y señal de poliadenilación (pA) en la lanzadera de plásmido pHM5, usando una estrategia de clonación de elección, para generar pHM5-GOI.
   NOTA: Como pAdFTC es un plásmido relativamente grande, se recomienda protocolos de preparación de plásmido clásicos para evitar sheering del ADN plas....

Results

Se muestran ejemplos Aquí representativos para la clonación, amplificación y purificación de preparaciones HCAdV. Una visión general de la estrategia de clonación (Figura 1) y ejemplos representativos para la clonación y la liberación del genoma HCAdV por enzimas de restricción digerir son proporcionados (Figura 2). Un patrón de restricción típica después de la liberación del casete GOI-expresión de pHM5 por PI Sce I y I-Ceu I digerir y.......

Discussion

El protocolo que aquí se presenta permite la purificación de los vectores basados ​​en adenovirus HCAdV tipo humano 5 basado en procedimientos descritos previamente ^4,12. El genoma HCAdV dentro del plásmido pAdFTC está desprovisto de todos los genes de adenovirus y sólo lleva a los 5 'y 3'-RTI y la señal de empaquetamiento. En esta estrategia, el HV AdNG163R-2 ⁴ proporciona todos los genes necesarios para la producción de virus eficiente en trans. Esto ofrece una capacidad de envas.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	digestión de restricción
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	digestión de restricción
T4 Ligasa	New Engand Biolabs	M0202S	ligadura
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restricción
NotI	New England Biolabs	R0189S	restricción, comgestión
Fosfatasa alcalina intestinal (CIP)	de ternerosNew England Biolabs	M0290S	desfosforilación de plásmidos digeridos
Higromicina B	PAN Biotech	P02-015	selección de CRE que expresa 116 células
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Medio de cultivo celular Hek293T
Medio esencial mínimo (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 medio de cultivo celular
Dulbecco' s solución salina tampón de fosfato (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	lavado de células, resuspensión de células
Frasco de almacenamiento de 250 ml	Sigma	CLS430281-24EA	infección de 116 células cultivadas en suspensión
500 ml centrífuga PP Tubesiga	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentación de células de cultivo
en suspensión matraz Spinner	Bellco	1965-61030	crecimiento de 116 células en suspensión
Ultra Clear Tubos de ultracentrífuga	Beckmann Coulter	344059	centrifugación en gradiente de densidad
Ultracentrífuga	Beckmann Coulter		centrifugación en gradiente
de densidad SW-41	Beckmann Coulter		centrifugación en gradiente de densidad
Spectrum Laboratories Spectrapor membrana	VWR	132129	tubos de diálisis
casetes de diálisis listos para usar	Thermo	66383	diálisis
de un disparo DH10B electrocompetente E. coli	invitrogen	C4040-52	transformación de reacciones de ligadura
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	aislamiento de ADN genómico
SuperFect Transfect Reactivo de transfección	Qiagen 301305		de 116 células
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	transfección de 116 células
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 táctil	Máquina Biorad		qPCR
Fenol / Cloroformo / Alcohol isoamílico	Carl Roth	A156.1	purificación de ADN
Cloruro de cesio	Carl Roth	8627.1	centrifugación en gradiente
densidad acetato de sodio 99%	Carl Roth	6773.2	precipitación de ADN
LB medio	Carl Roth	X968.3	medio de crecimiento bacteriano
etanol   99.8% puro	Carl Roth	9065.5	Precipitación y lavado del ADN
SDS 99.5%	Carl Roth	2326.2	tampón de lisis
EDTA	Carl Roth	8043.2	tampón de lisis
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	tampón de diálisis/ lisis
tampón glicerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	tampón de diálisis
MgCl2 98.5%	Carl Roth	KK36.2	tampón de diálisis
NaCl Carl	Roth	3957.1	opcional tampón de diálisis
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	opcional tampón de diálisis
sacarosa	Carl Roth	9286.1	opcional tampón de diálisis
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	Tampón de diálisis opcional
Tubos de 1,5 ml	Sarstedt	72.730.005	Almacenamiento de preparados víricos a -80 °C; C