Клонирование и крупномасштабное производство высокопроизводительного аденовирусные векторы на основе типа аденовируса человека 5
Summary
A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.
Abstract
High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.
Introduction
Для терапевтического применения генных это имеет большое значение, чтобы избежать цитотоксические и иммуногенные побочных эффектов, вызванных экспрессии вирусных белков, самой трансгена или на входящих вирусных белков. Аденовирусные векторы (ADV) широко используются для введения чужеродной ДНК в самых разнообразных клетках, чтобы исследовать воздействие трансгенной экспрессии 1,2. Наиболее продвинутая версия ADV представлена высокопроизводительных аденовирусных векторов (HCAdV), лишенных все вирусные кодирующие последовательности 3,4, и тем самым, предлагающих емкость упаковки до 35 кб в сочетании с низкой иммуногенности и низкой токсичностью 5-8. Из-за их высокой вместимости тары они позволяют доставки больших или нескольких трансгенов с помощью одного вектора дозу. Таким образом, они представляют собой ценный инструмент для научного сообщества.
В отличие от первого или второго поколения AdV хватает ранних генов Е1 и / или Е3, которые могут быть легко получены с использованием коммерческих наборов, VECTor строительство генома вируса и производство HCAdV является более сложным. Система для строительства HCAdV геномов на основе плазмиды, несущей pAdFTC HCAdV геном, лишенный всех вирусных кодирующих последовательностей и трансфер плазмиды pHM5 9-12. Любой интерес ген до 14 килограмм базами (кб) может быть клонирован в вектор трансфер pHM5, в котором сайт множественного клонирования в окружении признания / рассекая сайты самонаведения эндонуклеаз Пи сю I и I-Сеу I. Таким образом, клонированный ген интереса может быть выпущен подряд PI-сю I и I-I Céu переваривает для последующего направленного вставки в тех же сайтов рестрикции, присутствующих в геноме HCAdV, содержащейся в плазмиде pAdFTC. В pAdFTC сайт трансгенной инсерции расположен между PI-сю I и I-я Céu сайты расщепления в окружении извитости ДНК и некодирующих последовательностей аденовирусных, необходимых для генома упаковки, такие как 5 'и 3' инвертированные концевые повторы (СПУ)на обоих концах и упаковочной сигнала ниже по потоку от 5'ITR. Дополнительное извитости ДНК обеспечивает оптимальную размер конечного HCAdV генома в пределах от 27 до 36 кб, чтобы обеспечить эффективную упаковку в процессе производства вируса. Так pAdFTC большой плазмиды до 45 кб (в зависимости от размера вставленного трансгена) и использование наведения эндонуклеаз со сравнительно сайтов ДНК длиной распознавания проявляет сильное к ДНК, несколько шагов очистки необходимы во время передачи трансгена от pHM5 чтобы pAdFTC. Осторожное обращение избежать сдвига силы рекомендуется.
РМЭ о HCAdV генома в окружении я не сайтов рестрикции распознавания, расположенных непосредственно перед 5'ITR и ниже по течению от 3'ITR 12. Таким образом, HCAdV может быть освобожден от Not I переварить для последующего трансфекции вирусного генома в HCAdV производителем клеточной линии. Обратите внимание, что использование фермента рестрикции Not I для отнпростота вирусного генома из плазмиды pAdFTC означает, что вставлен трансген лишена сайтов узнавания не я ДНК. Клеток-продуцентов НЕК293 клеток, основанные (116 клеток) стабильно выразить Cre рекомбиназу. Для амплификации вируса клетки 116 с сочетанной инфекцией вируса-помощника (HV), обеспечивающей все гены, необходимые для ADV репликации и упаковки в транс 3,4. Гибридного является первым поколения AdV с floxed упаковки сигнал, который удаляется во амплификации вируса по Cre рекомбиназой выраженной в 116 клеток 4. Это гарантирует, что преимущественно HCAdV геномы, содержащие целостности упаковки сигнала encapsidated.
Предварительно усиление HCAdV выполняется путем проведения последовательных шагов пассирования в 116 клетки, выращенные на поверхности в культуре ткани блюд. После каждого прохода вирусные частицы высвобождаются из инфицированных клеток путем проведения трех последовательных шагов замораживания-оттаивания. С каждым прохождение большее число клеток, инфицированных1/3 из клеточного лизата из предыдущего прохода. Наконец лизата с последней стадии предварительной амплификации используют для инфицирования клеток-продуцентов выращивают в суспензии в вращаемой колбе при больших масштабах амплификации. Вирионы очищали из клеток суспензии, выполняя ультрацентрифугирования в цезия плотности хлорида градиента 4,12. С помощью этой процедуры пустые частицы и полностью собранные частицы делятся на два различных диапазонах. Для дальнейшего сосредоточить HCAdV частиц второй без постепенного шаг ультрацентрифугирование выполняется. Впоследствии в результате полосу, содержащую HCAdV собирают и диализуют против физиологическом буфере. Конечный вектор препараты характеризуются относительно числа абсолютных вирусных частиц, инфекционных частиц и уровня загрязнения HV. Абсолютные вирусные частицы могут быть определены путем лизиса вирусных частиц и измерением оптической плотности при 260 нм или при выполнении количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) 12. Инфекционность Пурвирусные частицы маньяков может быть определена путем измерения КПЦР HCAdV геномов, присутствующих в инфицированных клетках 3 ч после инфицирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленные здесь позволяет очистку HCAdV векторов на основе аденовируса человека типа 5 на основе описанных выше процедур 4,12. HCAdV генома в плазмиды pAdFTC лишена всех аденовирусов генов и только несет 5'- и 3'РМЭ и сигнал упаковки. В рамках этой стратегии ВЛ AdNG163R-2 4…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kröner-Fresenius foundation (EKFS).
Materials
| I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | restriction digest |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restriction digest |
| T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | ligation |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | restriction digest |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | restriction digest |
| Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | dephosphorylation of digested plasmids |
| Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | selection of CRE expressing 116 cells |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T cell culture medium |
| Minimal Essential Medium (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 cell culture medium |
| Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | washing of cells, resuspension of cells |
| 250 ml storage bottle | Sigma | CLS430281-24EA | infection of 116 cells grown in suspension |
| 500mL PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentation of cells from suspension culture |
| Spinner flask | Bellco | 1965-61030 | growth of 116 cells in suspension |
| Ultra Clear Ultracentrifuge tubes | Beckmann Coulter | 344059 | density gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| SW-41 rotor | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | dialysis tubing |
| ready-to-use dialysis cassettes | Thermo | 66383 | dialysis |
| one shot DH10B electrocompetent E. coli | invitrogen | C4040-52 | transformation of ligation reactions |
| PureYield™ Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
| peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | isolation of genomic DNA |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | tranfection of 116 cells |
| opti MEM (10 % FBS) | Gibco | 31985-062 | transfection of 116 cells |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | Biorad | qPCR machine | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carl Roth | A156.1 | purification of DNA |
| Cesium chloride | Carl Roth | 8627.1 | density gradient centrifugation |
| sodium acetate 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA precipitation |
| LB medium | Carl Roth | X968.3 | bakterial growth medium |
| ethanol 99,8% pure | Carl Roth | 9065.5 | DNA precipitation and washing |
| SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lysis buffer |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lysis buffer |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | dialysis buffer/ lysis buffer |
| glycerol 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | dialysis buffer |
| MgCl2 98,5% | Carl Roth | KK36.2 | dialysis buffer |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | optional dialysis buffer |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | optional dialysis buffer |
| sucrose | Carl Roth | 9286.1 | optional dialysis buffer |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | optional dialysis buffer |
| 1,5ml tubes | sarstedt | 72,730,005 | storage of virus preparations at -80°C |
Referencias
- Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
- Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).
- Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).
- Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).
- Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).
- Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).
- Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).
- Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).
- Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, (2001).
