Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Il fattore di trascrizione ubiquitariamente e costitutivamente espresso Interferone (IFN) Fattore di regolamentazione 3 (IRF3) è fondamentale per la prima linea di difesa contro i patogeni principalmente attraverso l'induzione di Interferone beta, ma anche attraverso l'induzione della chemochina (CC motivo) ligando 5 (CCL5 ) e diverse proteine antivirali tra cui proteine IFN-indotta con tetratricopeptide ripete IFIT1 / 2/3 1-3. Attivazione IRF3 è stata riportata a seguito dell'infezione da numerosi virus, o l'esposizione ad acido polyinosinic-policitidilico (poli I: C) o lipopolisaccaride (LPS) 4. È importante sottolineare che i virus più studiati sono evoluti meccanismi per eludere la risposta IRF3-mediata, e quindi sfuggire l'host difesa immunitaria innata 5. Pertanto, il monitoraggio di attivazione IRF3 è di grande importanza per comprendere i meccanismi molecolari del innata difesa ospite antivirale, ma anche di individuare la strategia utilizzata dai virus per contrastare questa risposta.
ent "> Molti rapporti pubblicati però fornire solo un'analisi limitata di attivazione IRF3 eseguito dal monitoraggio dell'induzione gene IRF3-bersaglio (IFNB1 e IFIT1) e / o luciferasi giornalista test gene accoppiato a bassa risoluzione di sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS PAGE) analisi delle IRF3. Tuttavia, numerosi studi biochimici, analisi del comportamento dei vari mutanti IRF3 e delucidazione struttura cristallina IRF3 6-11 hanno contribuito a stabilire che IRF3 è sottoposto ad una serie complessa di sequenziali modificazioni post-traduzionali dalla fosforilazione a più siti. L'insieme di fosforilazione coinvolti nell'attivazione IRF3 sembra essere dipendente dalla stimolo e più probabile del tipo di cellula. In cellule non infettate, IRF3 coesiste come specie non fosforilata e ipofosforilata contenente phosphoresidues, tra Thr135 e Ser173, in 1 -198 aa regione N-terminale 6,12-14. L'accumulo di questo ipofosforilata form di IRF3 è indotta da induttori di stress, fattori di crescita e che danneggiano il DNA agenti 6. La fosforilazione di residui Ser / Thr alla regione C-terminale della IRF3 contenente il dominio di transattivazione viene attivato dopo l'attivazione da parte di virus, poli I: C o LPS in un tipo cellulare dipendente manner 15-17. C-terminale fosforilazione di IRF3 coinvolge non meno di 7 siti phosphoacceptor distinte organizzate in due gruppi principali, Ser385 / Ser386 e Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, che ogni contribuiscono all'attivazione IRF3 attraverso dimerizzazione, nucleare accumulazione, l'associazione con il CREB proteine -binding (CBP) / coattivatori p300, legame con IFN risposta elemento sensibile (ISRE) sequenze consenso e transattivazione di geni bersaglio 9,10,17-19 DNA. La fosforilazione di Thr390 è anche pensato per contribuire alla virale IRF3 attivazione 20. Spettrometria di massa analisi dei IRF3 hanno dimostrato che Ser386, Thr390, Ser396 e Ser402 residui sono direttamente phosphorylatcato per l'inibitore di chinasi kB ε (IKKε) / TANK-binding chinasi 1 (TBK1) chinasi 9,10. È anche necessario fosforilazione ai residui C-terminale per la terminazione di attivazione IRF3 attraverso polyubiquitination e proteasoma-mediata degradazione 10. Questo processo è anche dipendente dalla fosforilazione in Ser339, che è necessaria per l'assunzione della isomerasi Pin1 propile 10,11. Specie IRF3 contenenti almeno fosfo-Ser339 / 386/396 residui sono considerati forme iperfosforilata. L'esatta sequenza e la funzione di ogni sito rimane una questione di discussione 10,21. E 'ormai chiaro che IRF3 attivato non rappresenta uno stato omogeneo, ma che diverse specie che presentano caratteristiche di fosforilazione attivati o dimerizzazione distinti esiste 10,22.Per fornire una comprensione completa di attivazione IRF3 in risposta a patogeni specifici, è quindi necessario characterize che delle specie attivati sono indotti. Induzione di geni bersaglio IRF3, IFNB1 e IFIT1, ha dimostrato di fornire una lettura-out affidabile per l'attivazione IRF3. Tuttavia, il monitoraggio espressione di questi geni non fa distinzioni tra i diversi stati di attivazione del IRF3. Un'analisi completa di stati di attivazione IRF3 in un ambiente particolare si basa sulla caratterizzazione dettagliata della sua fosforilazione e dimerization stato di 10. Fosforilata (modulo I), ipofosforilata (modulo II) e iperfosforilata (forme III e IV) forme IRF3 6,18,23 può essere risolto con successo dalla mobilità ridotta ad alta risoluzione analisi SDS-PAGE. Specie IRF3 monomeri e dimeri possono essere efficacemente identificati con analisi nativo-PAGE. Questi approcci sono notevolmente migliorate quando usato in combinazione con gli anticorpi diretti contro phosphospecific siti IRF3 phosphoacceptor distinte.
Protocolli standard consentono una scarsa risoluzione diproteine che non consentono la separazione efficiente di IRF3 distinte forme fosforilate. Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per realizzare la massima risoluzione per monitorare l'induzione di distinte specie IRF3 virus attivato mediante SDS-PAGE accoppiato ad nativo-PAGE in combinazione con immunoblot utilizzando anticorpi totali e phosphospecific. In vivo discriminazione tra i diversi attivato forme di IRF3 viene eseguita sulla base dei loro spostamenti mobilità osservati su SDS-PAGE. Inoltre, IRF3 monomero e dimero si distinguono per elettroforesi non denaturante. La combinazione di queste due tecniche complementari con immunoblot dimostra di essere un approccio accessibile e sensibile per acquisire tutte le informazioni necessarie per una completa analisi di attivazione fosforilazione mediata di IRF3.
Il protocollo che descriviamo qui costituito da una combinazione di alta risoluzione SDS-PAGE e native-PAGE accoppiato all'utilizzo di diversi anticorpi phosphospecific distinguere il monomero / dimero e phosphoforms I-IV di IRF3. Rilevazione adeguata di queste specie IRF3 è essenziale per caratterizzare completamente attivazione IRF3 in un ambiente specifico. Per esempio, LPS stimolazione dei macrofagi attivati porta alla formazione di dimerica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilata che presenta un ipofosforilata (m…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
Hepes | Bioshop | HEP001 | |
Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
EDTA | Bioshop | EDT001 | |
Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
Non-fat dry milk | Carnation | ||
Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |