Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
Yayg ve yapısal olarak ifade transkripsiyon faktörü İnterferon (IFN) Düzenleyici Faktör 3 (IRF3) çoğunlukla IFNβ indüksiyonu yoluyla patojenlere karşı ilk savunma hattı için kritik değil, aynı zamanda kemokin (CC motif) indüksiyonu ligandı 5 (CCL5 yoluyla ) ve tetratricopeptide ile IFN ile uyarılan proteini dahil olmak üzere birçok antiviral proteinlerdir IFIT1 / 2/3 3/1 tekrarlar. Ya da lipopolisakkarid (LPS) 4: IRF3 aktivasyonu poli-inozinik-polisitidilik asit (poli I Cı) için aşağıdaki sayıda virüs enfeksiyonu veya maruz kalma bildirilmiştir. Önemlisi, en çok çalışılan virüsler IRF3 aracılı yanıtı kaçmasına ve böylece ev sahibi doğuştan gelen bağışıklık savunma mekanizmaları 5 kaçmak için gelişmiştir. Böylece, IRF3 aktivasyon izleme doğuştan antiviral konak savunma moleküler mekanizmalarını anlamak için değil, aynı zamanda bu tepkiyi ortadan kaldırmak için virüsler tarafından kullanılan stratejiyi belirlemek için büyük önem taşımaktadır.
ent "> yayınlanmış bir çok rapor Ancak düşük çözünürlüklü, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezine bağlanmış IRF3-hedef gen indüksiyonu izlenmesi (IFNB1 ve IFIT1) tarafından gerçekleştirilen IRF3 aktivasyonu ve / veya lusiferaz raportör geni deneyinde sadece sınırlı analizi sağlar (SDS- PAGE) IRF3 analizi. Ancak, çok sayıda biyokimyasal çalışmalar çeşitli IRF3 mutantlar ve IRF3 kristal yapısı 6-11 aydınlatılması davranış analizi de fosforilasyonu ile sıralı post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi karmaşık tabi tutulması IRF3 kurmak katkıda Birden çok siteleri. IRF3 aktivasyonunda rol fosforilasyon grubu hücre tipine uyarıcı bağlıdır ve en muhtemel görünmektedir. enfekte edilmemiş hücrelerde, IRF3 fosforilatlanmamış ve hipofosforile türleri 1, Thr135 ve Ser173 içeren phosphoresidues, ihtiva eden birlikte görülmektedir -198 aa N-terminal bölgesi 6,12-14. Bu hipofosforile f birikimiIRF3 biçiminde olabilecektir stres indükleyicileri, büyüme faktörleri ve DNA'ya hasar veren ajanlar 6 tarafından indüklenir. Transaktivasyon domenini ihtiva eden IRF3 C-terminal bölgesinde Ser / Thr tortularının fosforilasyonu virüs ile aktivasyonunun takiben tetiklenmektedir, poli I: bir hücre tipine bağlı bir şekilde 15-17 C ve LPS. IRF3 C-terminal fosforilasyonu her dimerizasyonu yoluyla IRF3 aktivasyonu, nükleer birikimi, CREB ile birlikte katkı yapan iki ana grupta, Ser385 / Ser386 ve Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 düzenlenen en az 7 farklı phosphoacceptor sitesi içermektedir bağlayıcı protein (CBP) / p300 koaktivatör, hassas tepki elemanı (ISRE) konsensüs dizileri ve hedef genlerin 9,10,17-19 transaktivasyonunu IFN bağlama DNA. Thr390 fosforilasyonu, aynı zamanda, virüs kaynaklı IRF3 aktivasyonu 20 katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Kütle spektrometrisi IRF3 analizleri Ser386, Thr390, Ser396 ve Ser402 tortuları doğrudan doğruya phosphorylat olduğunu göstermiştirkB kinaz inhibitörü ε (IKKε) tarafından ed / TANK bağlayıcı kinaz 1 (TBK1) 9,10 kinaz. C-terminal tortularının fosforilasyonu de, aynı zamanda polıubikutın eklemeyi ve proteazom aracılı degradasyon 10 boyunca IRF3 aktivasyon sonlandırılması için gereklidir. Bu süreç aynı zamanda propil izomeraz Pin1 10,11 alımı için gerekli olan Ser339 de fosforilasyonu, bağlıdır. En az fosfo-Ser339 / 386/396 kalıntıları içeren IRF3 türleri hiperfosforile formlar olarak kabul edilir. Her sitenin tam sırası ve fonksiyon tartışma 10,21 meselesi olmaya devam etmektedir. Bu aktive IRF3 homojen bir devleti temsil etmez, ancak farklı fosforilasyon veya dimerizasyon karakteristiklerini gösteren farklı aktif türlerin 10,22 mevcut olduğu açıktır.Belirli patojenlere karşı yanıt olarak IRF3 aktivasyon tam bir anlaşılmasını sağlamak için, ch böylece gerekli olanuyarılmaktadır aktifleştirilen türlerin bu aracterize. IRF3 hedef genlerin, IFNB1 ve IFIT1 indüksiyonu, IRF3 aktivasyonu için güvenilir bir okunmasını sağladığı kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, bu genlerin ekspresyonunu takip ve kontrol IRF3 farklı aktivasyon durumları arasında ayrım yapmaz. Belirli bir ortamda IRF3 aktivasyon devletler kapsamlı bir analizi onun fosforilasyon ve dimerizasyon durumunun 10 detaylı karakterizasyonu dayanır. Fosforlanmamış (Biçim I), (Biçim II) ve hiperfosforile hipofosforile (formlar III ve IV) IRF3 formları 6,18,23 başarılı bir şekilde yüksek çözünürlük, SDS-PAGE analizinde azalan hareketlilik çözülebilir. Monomerik ve dimerik IRF3 türleri etkili bir nativ-PAGE analizi ile tespit edilebilir. Farklı IRF3 phosphoacceptor sitelerinin karşı fosfospesifık antikorlar ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman bu yaklaşımlar büyük ölçüde daha iyidir.
Standart protokoller kötü bir çözünürlük izinfarklı IRF3 fosforilatlanmış biçimlerine etkili ayrılmasına izin vermez proteinler. Burada, toplam ve fosfospesifık antikorlar kullanılarak bağışıklık beneklenme ile kombinasyon halinde doğal-PAGE bağlanmış SDS-PAGE kullanılarak farklı virüs aktive IRF3 türlerinin meydana getirmenin gözlenmesi için en yüksek çözünürlük elde etmek için detaylı bir prosedür açıklanmaktadır. Etkin arasında farklı in vivo ayrımı IRF3 formları SDS-PAGE üzerinde görülen hareketlilik vardiya dayalı yapılır. Buna ek olarak, IRF3 monomer ve dimer denatüre edici olmayan elektroforez ile ayırt edilebilir. İmmunoblotta bu iki tamamlayıcı tekniklerin kombinasyonu IRF3 fosforilasyonu aracılı aktivasyonu tam bir analizi için gerekli tüm bilgileri elde etmek için bir ekonomik ve duyarlı bir yaklaşım olduğunu kanıtlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif protokolü IRF3 dimerik / monomerik ve phosphoforms I-IV ayırt birçok fosfospesifık antikorların kullanımı bağlanmış yüksek çözünürlüklü SDS-PAGE ve nativ-PAGE bir kombinasyonundan oluşur. Bu IRF3 türlerin uygun algılama tam belirli bir ortamda IRF3 aktivasyonunu tanımlamak için gereklidir. Örneğin, aktive makrofajlar LPS uyarımı, hipofosforile edilmiş (Biçim II) sahip dimerik, Ser396 / 398 fosforile IRF3 oluşmasına yol açar, ancak SDS-PAGE 15 (Form III ve IV), desen…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
Referencias
- Juang, Y. T. et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., & Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N. et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., & Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., & Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J. et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y. et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K. et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M. et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F. et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T. et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G. et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., & Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B. et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M. et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A. et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., & Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996, (1998).
- Yoneyama, M. et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J. et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B. et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K. et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., & Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., & O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S. et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H. et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 248-254, (1976).
- Iwamura, T. et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388. (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., & Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A. et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N. et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
