Summary

IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

Published: January 24, 2016
doi:

Summary

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Abstract

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Introduction

遍在的および構成的に発現する転写因子、インターフェロン(IFN)調節因子3(IRF3)は、主に、IFNβの誘導により、病原体に対する防御の最初の行のために重要であるが、また、ケモカイン(CCモチーフ)の誘導リガンド5(CCL5を通じて)およびIFNにより誘導されるタンパク質を含むいくつかの抗ウイルスタンパク質テトラトリコペプチドとは、IFIT1 / 2/3 1〜3を繰り返します。またはリポポリサッカライド(LPS)4:IRF3の活性化は、多数のウイルスの感染、またはポリイノシン-ポリシチジル酸(CポリI)への曝露後に報告されています。重要なことは、ほとんど研究されたウイルスは、IRF3媒介応答を回避し、それによって宿主自然免疫防御5をエスケープする機構を進化させてきました。したがって、IRF3の活性化を監視する先天的抗ウイルス宿主防御の分子機構を理解するだけでなく、この応答に対抗するためにウイルスによって使用される戦略を同定するために非常に重要です。

ENT ">多くの公表された報告は、しかしながら、低解像度のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に結合IRF3標的遺伝子誘導のモニタリング(IFNB1およびIFIT1)によって実行IRF3の活性化および/ ​​またはルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの限定された分析を提供します(SDS- PAGE)IRF3の解析が、多数の生化学的研究は、様々なIRF3の変異体及びIRF3結晶構造6-11の解明の挙動の解析がでリン酸化により逐次翻訳後修飾の複雑なセットを施すことがIRF3を確立するために貢献しています複数のサイト。IRF3の活性化に関与するリン酸化のセットは、細胞型に刺激に依存して、最も可能性が高いと思われる。非感染細胞では、IRF3は1で、Thr135およびSer173を含むphosphoresiduesを含む非リン酸化および低リン酸化種として共存-198 AAのN末端 ​​領域6,12-14。この低リン酸化Fの蓄積IRF3のORMは、ストレス誘導物質、成長因子およびDNA損傷剤6によって誘導されます。細胞型に依存した方法で15〜17℃またはLPS:トランス活性化ドメインを含むIRF3のC末端領域におけるセリン/スレオニン残基のリン酸化は、ウイルス、ポリIによる活性化、次のトリガされます。 IRF3のC末端のリン酸化は、それぞれが二量体化、核蓄積、CREBとの会合を通じてIRF3の活性化に寄与することを二つの主クラスタ、Ser385 / Ser386およびSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405、で編成一切7未満の異なるホスホサイトを伴いません-結合タンパク質(CBP)/ P300の活性化補助因子、敏感な応答要素(ISRE)コンセンサス配列と標的遺伝子9,10,17-19のトランスをIFNするDNA結合。 Thr390のリン酸化はまた、ウイルス誘導IRF3の活性化20に寄与していると考えられます。質量分析は、Ser386、Thr390、Ser396およびSer402残基が直接phosphorylatであることを実証したIRF3の分析κBキナーゼεの阻害剤(IKKε)によりED / TANK結合キナーゼ1(TBK1)は9,10キナーゼ。 C末端残基でのリン酸化はまた、ポリユビキチン化およびプロテアソーム媒介分解10を介してIRF3活性化の終了のために必要とされます。このプロセスは、プロピルイソメラーゼPin1が10,11の募集のために必要であるSer339でのリン酸化に依存します。少なくともリン酸化Ser339 / 396分の386残基を含むIRF3種は、高リン酸化形態と考えられています。各サイトの正確な配列および機能が議論10,21の問題のまま。それは活性化したIRF3が均一な状態を表すものではありませんが、個別のリン酸化または二量体化特性を示す、異なる活性種が10,22に存在することが明らかです。

特定の病原体に応答して、IRF3の活性化の完全な理解を提供するために、それをCHする必要がありますaracterize活性種の誘導されます。 IRF3標的遺伝子、IFNB1およびIFIT1の誘導は、IRF3の活性化のための信頼性の高い読み出しを提供するように証明されています。しかし、これらの遺伝子の発現をモニターすることは、IRF3の異なる活性化状態を区別しません。特定の設定でIRF3活性化状態の包括的な分析は、そのリン酸化および二量体化状態10の詳細な特性に依存しています。非リン酸化(形態I)は、(フォームII)及び過低リン酸化(形態IIIおよびIV)IRF3形態6,18,23が正常に高解像度のSDS-PAGE分析を小さく移動度によって解決することができます。単量体および二量体IRF3種を効率的にネイティブPAGE分析によって同定することができます。異なるIRF3のホスホ部位に対して向けリン酸化特異的抗体と組み合わせて使用​​した場合、これらのアプローチは、大幅に改善されます。

標準的なプロトコルは、貧しい人々の解像度を可能にします明確なIRF3リン酸化型の効率的な分離を許可しないタンパク質です。ここでは、詳細に合計とリン酸化抗体を用いたイムノブロットとの組み合わせでネイティブ-PAGEに結合されたSDS-PAGEを使用して、個別のウイルス活性化IRF3種の誘導を監視するための最高の解像度を達成するための手順が記載されている。アクティブに異なるとの間で生体差別IRF3の形態は、SDS-PAGE上で観察され、それらの移動度シフトに基づいて行われます。また、IRF3モノマーおよびダイマーは、非変性電気泳動によって区別す​​ることができます。イムノブロットによるこれら二つの相補的な技術の組み合わせは、IRF3のリン酸化媒介活性化の完全な分析のためにすべての必要な情報を取得するための手頃な価格に敏感なアプローチであることが分かります。

Protocol

注:プロトコルはセンダイウイルス(センダイウイルス)を感染させたA549細胞を使用してここで説明されています。しかし、SDS-PAGEおよびネイティブPAGEのためのプロトコルはまた、これまでに試験された全てのヒトおよびマウスの細胞型、さまざまなIRF3を活性化する刺激9,15,19,24,25で刺激し、特に骨髄系細胞で動作します。 A549細胞の1感染 10%熱不活化?…

Representative Results

図2は、高解像度のSDS-PAGEによるWCEの決議後にIRF3総抗体およびSer396およびSer398に対するIRF3、リン酸化抗体を用いて検出されたIRF3の代表的なイムノブロット像を示します。刺激されていないA549細胞では、IRF3は50で二つのバンドと非リン酸化(I型)に対応し、SDS-PAGE上の53kDaの低リン酸化及び(II型)IRF3の種として検出されます。 3のためのSeVにA549細胞の曝?…

Discussion

私たちはここで説明するプロトコルは、IRF3の二量体/単量体とphosphoforms I〜IVを区別するためのいくつかのリン酸化抗体の使用に結合された高解像度のSDS-PAGEおよびネイティブPAGEの組み合わせで構成されます。これらIRF3の種の適切な検出が完全に特定の設定でIRF3の活性化を特徴づけるために不可欠です。例えば、活性化マクロファージのLPS刺激は、低リン酸化(II型)を示すが、(III型および…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

Materials

F12/Ham Life Technologies 11765-054 Warm in a 37°C bath before use.
Fetal bovine serum Life Technologies 12483-020
L-glutamine Life Technologies 25030-081
D-PBS Life Technologies 14190-144 For cell culture.
Trypsin/EDTA 0.25 % Life Technologies 25200-072
Sendai virus Cantell Strain Charles River Laboratories 600503
Hepes Bioshop HEP001
Sodium chloride (NaCl) Bioshop SOD001.5
EDTA Bioshop EDT001
Glycerol Bioshop GLY001.1 Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I7771 Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent
Leupeptin Bioshop LEU001
Aprotinin Bioshop APR600.25 
Sodium fluoride Sigma-Aldrich 201154
Sodium orthovanadate MP Biomedicals 159664 Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C.
p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich P1585
Beta-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G6376 
Bio-Rad Protein Assay Reagent  Bio-Rad 500-0006  Cytotoxic
Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % Bioshop ACR005  Cytotoxic
Tris-Base Bioshop DEO701
Hydrochloric acid (HCl) LabChem LC15320-4  Work under fume hood. Toxic and irritant.
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Bioshop SDS001.1  Irritant.
Amonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
TEMED Invitrogen 15524-010 Toxic and irritant.
Bromophenol blue Fisher Scientific B392-5
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system.
Glycine Bioshop GLN001.5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium hydroxide (NaOH) Bioshop SHY700  Irritant.
Nitrocellulose membrane (0.45mm) Bio-Rad 162-0115
Acetic acid glacial Bioshop ACE222.4 Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable.
Red ponceau Sigma-Aldrich P3504  
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911  For PBS composition for immunoblot.
Na2HPO4 Bioshop SPD307.5 For PBS composition for immunoblot.
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662  For PBS composition for immunoblot.
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906 For PBS-T-BSA composition for immunoblot.
Non-fat dry milk Carnation
Poly sorbate 20 (Tween) MP Biomedicals 103168 Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick.
Anti-IRF-3-P-Ser386 IBL-America 18783 Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw.
Anti-IRF-3-P-Ser396 Home made19 Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) Cell Signaling Technology 4947s Store at -20oC.
Anti-IRF-3-P-Ser398 Home made15 Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.
Anti-IRF-3-full length Actif motif 39033 Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw.
Anti-IRF3-NES IBL-America 18781 Store aliquoted at -20oC.
Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus Perkin-Elmer Life Sciences NEL104001EA
LAS4000mini CCD camera apparatus GE healthcare
SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range Bio-Rad 161-0317 Store aliquoted at -20oC.

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check_url/es/53723?article_type=t

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Robitaille, A. C., Mariani, M. K., Fortin, A., Grandvaux, N. A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3. J. Vis. Exp. (107), e53723, doi:10.3791/53723 (2016).

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