고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
재하와 구조적으로 표현 전사 인자 인터페론 (IFN) 규제 요인 3 (IRF3)는 주로 IFNβ의 유도를 통해 병원균에 대한 방어의 첫 번째 줄에 중요뿐만 아니라, 케모카인 (CC 모티브)의 유도 리간드 (5) (CCL5 통해 ) 및 tetratricopeptide와 인터페론 유도 단백질 등 여러 가지 바이러스 단백질은 IFIT1 / 2 / 3월 1일부터 3일까지 반복합니다. 또는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 4 : IRF3 활성화 polyinosinic – polycytidylic 산 (C 폴리 I)에 다음과 같은 다수의 바이러스 감염 또는 노출을보고되었다. 중요한 것은, 대부분의 연구 바이러스는 IRF3 매개 응답을 회피하고, 이에 호스트 선천성 면역 방어 5 탈출 메커니즘을 진화했다. 따라서 IRF3 활성화를 모니터링하는 것은 선천성 바이러스 숙주 방어의 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 또한 본 반응을 방해하는 바이러스에 의해 사용되는 전략을 식별하는 데 매우 중요하다.
ENT "> 많은 출판 리포트 그러나 저해상도 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 IRF3 표적 유전자 도입의 모니터링 (IFNB1 및 IFIT1)에 의해 수행 IRF3 활성화 및 / 또는 루시퍼 라제 리포터 유전자 분석의 제한된 분석을 제공 (SDS- PAGE) IRF3 분석. 그러나, 다수의 생화학 적 연구는 다양한 IRF3 돌연변이 IRF3 결정 구조 6-11의 해명의 행동 분석에서의 인산화에 의해 순차 번역 후 변형의 복잡한 실시된다 IRF3를 확립 기여 여러 사이트. IRF3 활성화에 관여하는 인산화의 집합은 세포 유형의 자극에 따라 가장 가능성이있을 것으로 보인다. 감염되지 않은 세포에서 IRF3 비 인산화 및 인산화되어 종은 1, Thr135 및 Ser173 포함 phosphoresidues을 포함하는 것으로 공존 -198 AA의 N 말단 지역 6,12-14.이 인산화되어 F의 축적IRF3의 ORM은 스트레스 유도, 성장 인자 및 DNA를 손상 에이전트 (6)에 의해 유도된다. 전이 활성화 영역을 포함 IRF3의 C 말단 영역에서 빼앗아 /의 Thr 잔기의 인산화에 의해 활성화 바이러스는 다음의 트리거됩니다 폴리 I : 셀형 의존적 15-17에서 C 또는 LPS. IRF3의 C- 말단 인산화는 각각 이합체를 통해 IRF3 활성화, 핵 축적, CREB와 관련에 기여, 두 가지 주요 클러스터, Ser385 / Ser386 및 Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 구성에는보다 7 별개의 phosphoacceptor 사이트를 포함하지 – 결합 단백질 (CBP) / P300의 공동 활성화 인자, 민감한 반응 요소 (ISRE) 합의 시퀀스 및 표적 유전자 9,10,17-19의 전이 활성화를 IFN하는 DNA 결합. Thr390의 인산화는 또한 바이러스 – 유도 IRF3 활성화 (20)에 기여하는 것으로 생각된다. 질량 분석은 IRF3 분석 Ser386, Thr390, Ser396 및 Ser402 잔류 물이 직접 phosphorylat 것을 증명하고있다κB 키나제 ε의 억제제 (IKKε)에 의해 에드 / 탱크 결합 키나제 1 (TBK1)는 9,10 키나아제. C- 말단 잔기의 인산화는 polyubiquitination 및 프로 테아 매개 저하 (10)를 통해 IRF3 활성화의 종료가 필요합니다. 이 과정은 또한 프로필 이성화 핀 1 10, 11의 채용에 필요한 Ser339의 인산화에 따라 달라집니다. 적어도 포스 Ser339 / 396분의 386 잔류 물을 포함 IRF3 종은 hyperphosphorylated 형태로 간주됩니다. 각 사이트의 정확한 순서와 기능은 토론 10,21의 문제가 남아있다. 그것은 활성화 IRF3가 균일 한 상태를 나타내지 않는,하지만 별개의 인산화 또는 이량 특성을 나타내는 서로 다른 활성 종 10,22 존재 이니까 분명하다.특정 병원체에 응답 IRF3 활성화의 완전한 이해를 제공하기 위해, 그것은으로 Ch 필요가있다유도 활성 종의 어느 aracterize. IRF3 대상 유전자, IFNB1 및 IFIT1의 유도는 IRF3 활성화를위한 신뢰할 수있는 판독을 제공하기 위해 입증되었습니다. 그러나, 이들 유전자의 발현을 모니터링 IRF3의 다른 활성화 상태를 구분하지 않습니다. 특정 설정에서 IRF3 활성화 상태의 포괄적 인 분석은 인산화 및 이량 상태 (10)의 상세한 특성에 의존한다. Unphosphorylated (폼 나는), (II 형) 및 hyperphosphorylated, 인산화 (형태 III 및 IV) IRF3 양식 6,18,23이 성공적으로 고해상도의 SDS-PAGE 분석 감소 이동성을 해결할 수 있습니다. 단량체 및 이량 IRF3 종 효율적 네이티브-PAGE 분석에 의해 식별 될 수있다. 별개의 IRF3 phosphoacceptor 부위에 대해 지시 한 포스 포 항체와 조합하여 사용할 때 이러한 방법이 크게 개선된다.
표준 프로토콜의 가난한 해상도를 허용별개의 IRF3 인산화 된 형태의 효율적인 분리를 허용하지 않습니다 단백질. 여기서는 총 및 포스 포 – 항체를 사용하여 면역 블롯과 조합 네이티브-PAGE에 결합 SDS-PAGE를 이용하여 고유 바이러스 활성 IRF3 종의 유도를 모니터링하기 위해 높은 해상도를 얻기 위해 상세 절차를 설명한다. 활성화 된 다른 간의 생체 차별 IRF3 형태의 SDS-PAGE상에서 관찰 그들의 이동성 변화에 기초하여 수행된다. 또한 IRF3 단량체 및 이량 체는 비 변성 전기 영동으로 구별 될 수있다. 면역 이들 두 기법의 상보 결합 IRF3의 인산화 – 매개 활성의 완전한 분석에 필요한 모든 정보를 획득하기위한 저렴하고 민감한 방식으로 증명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 여기 설명 프로토콜 IRF3의 이합체 / 단량체 및 phosphoforms I-IV를 구별하기 위해 여러 포스 포 항체의 용도에 결합 고해상도 SDS-PAGE 및 네이티브-PAGE의 조합으로 이루어져있다. 이 IRF3 종의 적절한 검출은 완전히 특정 설정에 IRF3 활성화를 특성화하는 것이 필수적이다. 예를 들어, 활성화 된 대 식세포의 LPS의 자극, 인산화 (II 형)를 전시 이량 체, Ser396 / 398 인산화 IRF3의 형성을 유도하지만, S…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
Referencias
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