Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Le facteur de transcription ubiquitaire et exprimé de façon constitutive interféron (IFN) Facteur de réglementation 3 (IRF3) est crucial pour la première ligne de défense contre les agents pathogènes principalement par l'induction d'IFNß, mais aussi grâce à l'induction de la chimiokine (CC motif) ligand 5 (CCL5 ) et de plusieurs protéines, y compris la protéine antivirale de l'IFN-induite avec tétratricopeptide répète IFIT1 / 2/3 de 1-3. Activation de IRF3 a été rapporté ci-après infection avec de nombreux virus, ou l'exposition à l'acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou un lipopolysaccharide (LPS) 4. Surtout, les virus les plus étudiés ont développé des mécanismes pour échapper à la réponse de IRF3 médiation, et ainsi échapper à l'hôte de la défense immunitaire innée 5. Ainsi, le suivi de l'activation IRF3 est d'une grande importance pour comprendre les mécanismes moléculaires de la défense de l'hôte antivirale innée, mais aussi d'identifier la stratégie utilisée par les virus pour contrer cette réponse.
ent "> De nombreux rapports publiés fournissent cependant seule une analyse limitée de l'activation du IRF3 effectuée par la surveillance de l'induction du gène IRF3-cible (IFNB1 et IFIT1) et / ou de dosage de gène rapporteur de luciférase couplée à une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de Polyacrylamide à faible résolution de sodium (SDS- PAGE) analyse des IRF3. Cependant, de nombreuses études biochimiques, l'analyse du comportement des différents mutants IRF3 et l'élucidation de la structure cristalline de IRF3 6-11 ont contribué à établir que IRF3 est soumis à un ensemble complexe de modifications post-traductionnelles séquentielles par phosphorylation au plusieurs sites. L'ensemble de phosphorylation impliqué dans l'activation des IRF3 semble être dépendante de la stimulation et le plus probable sur le type cellulaire. Dans les cellules non infectées, IRF3 coexiste comme espèce non phosphorylés et hypophosphorylé contenant phosphoresidues, y compris Thr135 et Ser173, dans la 1 -198 aa région N-terminale 6,12-14. L'accumulation de cette hypophosphorylé form de IRF3 est induite par des inducteurs de stress, des facteurs de croissance et des agents endommageant l'ADN 6. La phosphorylation de résidus Ser / Thr dans la région C-terminale de IRF3 contenant le domaine de transactivation est déclenchée suite à l'activation par des virus, le poly I: C, ou le LPS dans un type de cellules de manière dépendante de 15 à 17. C-terminal phosphorylation de IRF3 implique pas moins de 7 sites de phosphoacceptor distincts organisés en deux groupes principaux, Ser385 / Ser386 et Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, qui contribuent chacun à l'activation de IRF3 par dimérisation, accumulation nucléaire, association avec le CREB protéine liant le (CBP) / co-activateurs p300, se liant à l'IFN élément de réponse sensible (ISRE) des séquences consensus et la transactivation de gènes cibles 9,10,17-19 ADN. La phosphorylation de Thr390 est également pensé pour contribuer à IRF3 activation induite par le virus 20. Analyses de spectrométrie de masse IRF3 ont démontré que les résidus Ser386, Thr390, Ser396 et Ser402 sont directement phosphorylated par l'inhibiteur de kinase kB ε (IKKε) / TANK contraignant kinase 1 (TBK1) kinases 9,10. Phosphorylation sur les résidus C-terminal est également nécessaire pour la terminaison de l'activation de IRF3 travers polyubiquitination et le protéasome de dégradation 10. Ce processus est également dépendante de la phosphorylation sur Ser339, qui est nécessaire pour le recrutement du propyle isomérase Pin1 10,11. Espèces IRF3 contenant au moins phospho-Ser339 / 386/396 résidus sont considérés comme des formes hyperphosphorylées. La séquence exacte et la fonction de chaque site reste un sujet de discussion 10,21. Il est maintenant clair que IRF3 activé ne représente pas un état homogène, mais que les différentes espèces activées présentant des caractéristiques de phosphorylation ou dimérisation distinctes existent 10,22.Pour fournir une compréhension complète de l'activation de IRF3 en réponse à des agents pathogènes spécifiques, il est donc nécessaire de characterize laquelle des espèces activées sont induites. L'induction de gènes cibles, de IRF3 IFNB1 et IFIT1, est révélée fournir une lecture fiable de l'activation du IRF3. Toutefois, le suivi expression de ces gènes ne fait pas de distinction entre les différents états d'activation du IRF3. Une analyse complète des états d'activation IRF3 dans un contexte particulier repose sur la caractérisation détaillée de sa phosphorylation et dimérisation état 10. Phosphorylée (formulaire I), hypophosphorylée (forme II) et (hyperphosphorylées formes III et IV) de formes IRF3 6,18,23 peut être résolu avec succès par une mobilité réduite en haute résolution analyse SDS-PAGE. Espèces IRF3 monomères et dimères peuvent être efficacement identifiés par analyse PAGE natif. Ces approches sont grandement améliorées lorsqu'il est utilisé en combinaison avec des anticorps dirigés contre les sites phosphospécifiques IRF3 de phosphoacceptor distinctes.
Les protocoles standard permettent une faible résolution deprotéines qui ne permettent pas une séparation efficace des IRF3 distincte formes phosphorylée. Ici, nous décrivons en détail une procédure pour obtenir la plus haute résolution pour surveiller l'induction d'espèces IRF3 de virus activé distinctes en utilisant SDS-PAGE couplé à PAGE natif en combinaison avec immunoblot utilisant des anticorps totaux et phosphospécifiques. In vivo discrimination entre les différentes activé formes de IRF3 est effectuée sur la base de leurs quarts de mobilité observées sur SDS-PAGE. En outre, le monomère et le dimère IRF3 peuvent être distingués par électrophorèse non dénaturantes. La combinaison de ces deux techniques complémentaires avec immunotransfert révèle être une approche abordable et sensible à l'acquisition de toutes les informations nécessaires pour une analyse complète de l'activation de la phosphorylation médiée par IRF3.
Le protocole que nous décrivons ici se compose d'une combinaison de haute résolution SDS-PAGE et PAGE natif couplé à l'utilisation de plusieurs anticorps phosphospécifiques à distinguer le monomère / dimère et phosphoforms I-IV de IRF3. Détection approprié de ces espèces IRF3 est essentiel pour caractériser complètement l'activation de IRF3 dans un contexte spécifique. Par exemple, LPS stimulation de macrophages activés conduit à la formation de dimères, Ser396 / 398 IRF3 phosphorylée qui p…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
Hepes | Bioshop | HEP001 | |
Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
EDTA | Bioshop | EDT001 | |
Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
Non-fat dry milk | Carnation | ||
Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |