Высокое разрешение метод контроля Фосфорилирование-зависимая активация IRF3
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
Повсеместно и конструктивно выражается фактором транскрипции интерферон (ИФН) Нормативно-фактор 3 (IRF3) имеет решающее значение для первой линии обороны против патогенов, главным образом, через индукцию IFNβ, но и через индукцию хемокинов (CC мотив) лиганда 5 (CCL5 ) и несколько противовирусных белков, включая IFN-индуцированной белка с tetratricopeptide повторяет IFIT1 / 2/3 1-3. Активация IRF3 сообщается после инфекции с многочисленными вирусами, или воздействия полиинозиновой-полицитидиловая кислоты (поли I: C) или липополисахарида (ЛПС) 4. Важно отметить, что наиболее изученными вирусы эволюционировали механизмы, чтобы уклониться от ответа IRF3-опосредованной, и тем самым избежать хозяина врожденная иммунная защита 5. Таким образом, следить за активацией IRF3 имеет большое значение для понимания молекулярных механизмов врожденного антивирусного защиты хозяина, но и определить стратегию, используемую вирусов, чтобы противодействовать этот ответ.
ЛОР "> Многие опубликованных отчетов, однако обеспечивают лишь ограниченный анализ активации IRF3 исполнении мониторинга индукции IRF3-гена-мишени (IFNB1 и IFIT1) и / или гена люциферазы анализа в сочетании с электрофорезом додецилсульфата полиакриламидном геле с низким разрешением натрия (SDS- СТР) анализ IRF3. Тем не менее, многочисленные биохимические исследования, анализ поведения различных IRF3 мутантов и выяснения IRF3 кристаллической структуры 6-11 способствовали установить, что IRF3 подвергается сложной совокупности последовательных пост-трансляционных модификаций путем фосфорилирования в несколько сайтов. В комплект фосфорилирования, участвующих в активации IRF3, кажется, зависит от стимулов и, скорее всего, от типа клеток. В неинфицированных клеток, IRF3 сосуществует, как нефосфорилированный и hypophosphorylated видов содержащий phosphoresidues, в том числе Thr135 и Ser173, в 1 -198 аа N-терминальная область 6,12-14. Накопление этого hypophosphorylated FОРМ по IRF3 индуцируется стрессом индукторов, факторов роста и агентов, повреждающих ДНК 6. Фосфорилирование Ser / Thr остатков на С-концевой области IRF3 содержащей домен трансактивации срабатывает после активации вирусами, поли I: С или ЛПС в типа клеток зависимым образом 15-17. С-концевой фосфорилирования IRF3 не включает в себя не менее 7 различных phosphoacceptor сайты, организованные в двух основных кластеров, Ser385 / Ser386 и Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, что каждый свой вклад в активацию IRF3 через димеризации, ядерной накопления, совместно с CREB связывающий белок (СВР) / P300 коактиваторами, связывания ДНК с IFN чувствительный элемент ответа (ISRE) консенсусные последовательности и трансактивацию генов-мишеней 9,10,17-19. Фосфорилирование Thr390 также думал, внести свой вклад в вирусиндуцированного активации IRF3 20. Масс-спектрометрия анализа IRF3 показали, что Ser386, Thr390, Ser396 и Ser402 остатки непосредственно phosphorylatред ингибитора киназы кВ е (IKKε) / БАК-связывающий киназы 1 (TBK1) киназ 9,10. Фосфорилирование на остатках C-терминал также требуется для прекращения активации IRF3 через polyubiquitination и протеасомного-опосредованной деградации 10. Этот процесс также зависит от фосфорилирования Ser339 в, которое необходимо для вербовки пропильного изомераза Pin1 10,11. IRF3 видов, содержащие, по крайней мере фосфо-Ser339 / 386/396 остатков рассматриваются гиперфосфорилированного формы. Точная последовательность и функции каждого сайта по-прежнему вызывает дискуссии 10,21. Теперь ясно, что активированный IRF3 не представляют однородного состояния, но различные виды активированного проявляющие различные фосфорилирования или димеризации характеристики существуют 10,22.Для обеспечения полного понимания активации IRF3 в ответ на конкретные патогенов, он, таким образом, необходимо спaracterize котором активированных видов индуцируются. Индукция генов-мишеней IRF3, IFNB1 и IFIT1, доказала, чтобы обеспечить надежную считывание для активации IRF3. Тем не менее, мониторинг экспрессии этих генов не различать разных государств активации IRF3. Всесторонний анализ IRF3 состояниях активации в конкретных условиях зависит от детальной характеристики ее фосфорилирования и димеризации статуса 10. Нефосфорилированной (форма I) hypophosphorylated (форма II) и (гиперфосфорилированного формы III и IV), IRF3 формы 6,18,23 может быть успешно решена с помощью ограниченной подвижностью в высоком разрешении анализа SDS-PAGE. Мономерные и димерных видов IRF3 может быть эффективно определены путем анализа родном странице. Эти подходы значительно улучшена при использовании в сочетании с phosphospecific антител, направленных против различных сайтов IRF3 phosphoacceptor.
Стандартные протоколы позволяют плохой разрешениебелки, которые не позволяют эффективное разделение отличие IRF3 фосфорилированными форм. Здесь мы подробно описать процедуру, чтобы добиться самого высокого разрешения для мониторинга индукции различных вирусных активирована видов IRF3 использованием SDS-PAGE, соединенный с родной страницы в сочетании с иммуноблот помощью всего и phosphospecific антител. В естественных условиях дискриминации между различными активирована Формы IRF3 выполняется на основании их подвижности сдвигов, наблюдаемых на SDS-PAGE. Кроме того, IRF3 мономера и димера можно отличить по неденатурирующих электрофореза. Сочетание этих двух дополнительных методов с иммуноблот оказывается доступным и чувствительный подход, чтобы приобрести всю необходимую информацию для полного анализа фосфорилирования-опосредованной активации IRF3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол описан здесь состоит из комбинации высокого разрешения SDS-PAGE и родной-PAGE в сочетании с использованием нескольких phosphospecific антител, чтобы отличить мономерный / димерный и phosphoforms I-IV из IRF3. Соответствующее определение этих видов IRF3 важно в полной мере характеризуют активацию IRF3 в…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
Referencias
- Juang, Y. T. et al. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).
- Lin, R., & Hiscott, J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity. Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).
- Grandvaux, N. et al. Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes. J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).
- Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., & Fitzgerald, K. A. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection. Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).
- Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., & Hiscott, J. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).
- Servant, M. J. et al. Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3. J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).
- Qin, B. Y. et al. Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation. Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).
- Takahasi, K. et al. X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications. Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).
- Mori, M. et al. Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation. J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).
- Clement, J. F. et al. Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association. J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).
- Saitoh, T. et al. Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1. Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).
- Wathelet, M. G. et al. Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo. Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).
- Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., & Howley, P. M. Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).
- Zhang, B. et al. The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response. Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).
- Solis, M. et al. Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages. Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).
- Soucy-Faulkner, A. et al. Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression. PLoS Pathog. 6 (6), e1000930 (2010).
- Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., & Hiscott, J. Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation. Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996, (1998).
- Yoneyama, M. et al. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).
- Servant, M. J. et al. Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA. J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).
- Bergstroem, B. et al. Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3). J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).
- Takahasi, K. et al. Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change. Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).
- Noyce, R. S., Collins, S. E., & Mossman, K. L. Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry. J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).
- McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., & O'Neill, L. A. Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation. J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).
- Oliere, S. et al. HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). PLoS Pathog. 6 (11), e1001177 (2010).
- Kato, H. et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 248-254, (1976).
- Iwamura, T. et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes Cells. 6 (4), 375-388. (2001).
- tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., & Hiscott, J. Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation. J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).
- Bibeau-Poirier, A. et al. Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation. J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).
- Grandvaux, N. et al. Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5. J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).
