Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3
Summary
Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.
Abstract
The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon β and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.
Introduction
El factor de transcripción expresado doquier y constitutivamente interferón (IFN) Factor de Regulación 3 (IRF3) es fundamental para la primera línea de defensa contra los patógenos, principalmente a través de la inducción de IFNß, pero también a través de la inducción de la quimiocina (motivo CC) ligando 5 (CCL5 ) y varias proteínas antivirales incluyendo la proteína inducida por IFN con tetratricopeptide repite IFIT1 / 2/3 a 1-3. Activación IRF3 ha sido reportado después de la infección con numerosos virus, o la exposición a ácido poliinosínico policitidílico (poli I: C) o lipopolisacárido (LPS) 4. Es importante destacar que los virus más estudiadas han desarrollado mecanismos para evadir la respuesta mediada por IRF3, y por lo tanto escapar de la defensa inmune innata 5 host. Por lo tanto, el seguimiento de la activación IRF3 es de gran importancia para comprender los mecanismos moleculares de la defensa del huésped antiviral innata, sino también para identificar la estrategia usada por los virus para contrarrestar esta respuesta.
ent "> Muchos informes publicados sin embargo proporcionan sólo un análisis limitado de la activación IRF3 realizado por el seguimiento de la inducción de genes IRF3-objetivo (IFNB1 y IFIT1) y / o ensayo de gen informador de luciferasa acoplado a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de baja resolución de sodio (SDS- PAGE) análisis de IRF3. Sin embargo, numerosos estudios bioquímicos, el análisis del comportamiento de los diversos mutantes IRF3 y elucidación de la estructura cristalina IRF3 6 a 11 han contribuido a establecer que IRF3 se somete a un complejo conjunto de modificaciones post-traduccionales secuenciales por fosforilación en múltiples sitios. El conjunto de fosforilación implicado en la activación IRF3 parece ser dependiente del estímulo y lo más probable en el tipo de célula. En las células no infectadas, IRF3 coexiste como especies no fosforilados y hypophosphorylated que contiene phosphoresidues, incluyendo Thr135 y Ser173, en el 1 -198 aa región N-terminal 6,12-14. La acumulación de este f hipofosforiladaorm de IRF3 es inducida por inductores de estrés, factores de crecimiento y agentes que dañan el ADN 6. La fosforilación de residuos de Ser / Thr en la región C-terminal de IRF3 que contiene el dominio de transactivación se desencadena después de la activación por virus, poli I: C o LPS en un tipo de célula de manera dependiente 15-17 de. Fosforilación C-terminal de IRF3 implica no menos de 7 sitios phosphoacceptor distintos organizados en dos grupos principales, Ser385 / Ser386 y Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, que cada contribuir a la activación IRF3 a través de la dimerización, la acumulación nuclear, asociación con la CREB -la proteína de unión (CBP) / coactivadores p300, la unión a IFN elemento de respuesta sensible (ISRE) secuencias consenso y transactivación de los genes diana 9,10,17-19 ADN. La fosforilación de Thr390 también se cree que contribuyen a la activación inducida por el virus IRF3-20. Los análisis de espectrometría de masas de IRF3 han demostrado que los residuos Ser386, Thr390, Ser396 y Ser402 son directamente phosphorylatcado por el inhibidor de quinasa kappa B ε (IKKε) / unión TANQUE-quinasa 1 (TBK1) quinasas 9,10. La fosforilación en los residuos C-terminal también es necesaria para la terminación de la activación a través de IRF3 polyubiquitination y la degradación mediada por proteasoma-10. Este proceso es también dependiente de la fosforilación en Ser339, que es necesaria para la contratación de la isomerasa Pin1 propilo 10,11. Especies IRF3 que contienen al menos fosfo-Ser339 / 386/396 residuos se consideran formas hiperfosforilada. La secuencia exacta y la función de cada sitio sigue siendo un tema de discusión 10,21. Ahora está claro que IRF3 activado no representa un estado homogéneo, pero existe esa especie activados diferentes expositoras de fosforilación o dimerización características distintas 10,22.Para proporcionar una comprensión completa de la activación IRF3 en respuesta a patógenos específicos, lo que es necesario a characterize cuál de las especies activadas son inducidos. La inducción de genes diana IRF3, IFNB1 y IFIT1, ha demostrado proporcionar una lectura fiable para la activación IRF3. Sin embargo, el seguimiento expresión de estos genes no distingue entre los diferentes estados de activación de IRF3. Un análisis completo de estados de activación IRF3 en un ambiente particular, se basa en la caracterización detallada de su fosforilación y dimerización estado 10. No fosforilada (formulario I), hypophosphorylated (forma II) y hiperfosforilada (formas III y IV) formas IRF3 6,18,23 se puede resolver con éxito por la movilidad reducida en alta resolución de análisis de SDS-PAGE. Especies monoméricas y diméricas IRF3 se pueden identificar de manera eficiente por análisis de PAGE nativa. Estos enfoques se mejoran en gran medida cuando se utiliza en combinación con anticuerpos fosfoespecíficos dirigidos contra sitios phosphoacceptor IRF3 distintas.
Protocolos estándar permiten una pobre resolución deproteínas que no permite la separación eficiente de los distintos IRF3 formas fosforiladas. Aquí se describe en detalle un procedimiento para lograr la más alta resolución para monitorizar la inducción de especies IRF3 virus activado por distintos utilizando SDS-PAGE acoplado a-PAGE nativa en combinación con inmunoblot utilizando anticuerpos totales y fosfoespecíficos. In vivo discriminación entre las diferentes activado formas de IRF3 se realiza sobre la base de sus turnos de movilidad observados en SDS-PAGE. Además, IRF3 monómero y el dímero se pueden distinguir por electroforesis no desnaturalizantes. La combinación de estas dos técnicas complementarias con inmunoblot resulta ser un enfoque accesible y sensible a adquirir toda la información necesaria para un análisis completo de la activación de la fosforilación mediada por IRF3.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo se describe aquí consiste en una combinación de alta resolución y SDS-PAGE-PAGE nativa acoplada a la utilización de varios anticuerpos fosfoespecíficos para distinguir el monomérica / dimérica y phosphoforms I-IV de IRF3. Detección adecuada de estas especies IRF3 es esencial para caracterizar completamente la activación IRF3 en un entorno específico. Por ejemplo, LPS estimulación de macrófagos activados conduce a la formación de dimérica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilada que exhibe una hypophosph…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank previous and current members of the laboratory for development of the protocols. The work was supported by funding from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] and from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012]. NG is recipient of a Tier II Canada Research Chair. AR holds a studentship from the training program of the Respiratory Health Research Network from the Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).
Materials
| F12/Ham | Life Technologies | 11765-054 | Warm in a 37°C bath before use. |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 12483-020 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| D-PBS | Life Technologies | 14190-144 | For cell culture. |
| Trypsin/EDTA 0.25 % | Life Technologies | 25200-072 | |
| Sendai virus Cantell Strain | Charles River Laboratories | 600503 | |
| Hepes | Bioshop | HEP001 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Bioshop | SOD001.5 | |
| EDTA | Bioshop | EDT001 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I7771 | Registred trademark corresponding to Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol (Nonidet P-40) detergent |
| Leupeptin | Bioshop | LEU001 | |
| Aprotinin | Bioshop | APR600.25 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | Activation of sodium orthovanadate 0.2M : 1) Ajust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthotovanadate solution may vary with lots of chemical. 2) The solution is yellow at pH 10.0. 3) Boil until colorless. 4) Cool to RT. 5) Reajust the pH to 10.0 and repat steps 3-4 until the solution remains colorless and stabilizes at 10.0. Store the activated sodium orthovanadate aliquots at -20°C. |
| p-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Beta-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G6376 | |
| Bio-Rad Protein Assay Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | Cytotoxic |
| Acrylamide/Bis-Acrylamide (37.5 : 1) 40 % | Bioshop | ACR005 | Cytotoxic |
| Tris-Base | Bioshop | DEO701 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | LabChem | LC15320-4 | Work under fume hood. Toxic and irritant. |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.1 | Irritant. |
| Amonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | Toxic and irritant. |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B392-5 | |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Work under fume hood. Toxic to the nervous system, mucous membranes. May be toxic to upper respiratory tract, eyes, central nervous system. |
| Glycine | Bioshop | GLN001.5 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Bioshop | SHY700 | Irritant. |
| Nitrocellulose membrane (0.45mm) | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Acetic acid glacial | Bioshop | ACE222.4 | Work under fume hood. Toxic, irritant and flammable. |
| Red ponceau | Sigma-Aldrich | P3504 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | For PBS composition for immunoblot. |
| Na2HPO4 | Bioshop | SPD307.5 | For PBS composition for immunoblot. |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | For PBS composition for immunoblot. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | For PBS-T-BSA composition for immunoblot. |
| Non-fat dry milk | Carnation | ||
| Poly sorbate 20 (Tween) | MP Biomedicals | 103168 | Cut the extreminity of the tip and pipet slowly as it is very thick. |
| Anti-IRF-3-P-Ser386 | IBL-America | 18783 | Store aliquoted at -20oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF-3-P-Ser396 | Home made19 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G) | Cell Signaling Technology | 4947s | Store at -20oC. |
| Anti-IRF-3-P-Ser398 | Home made15 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. | |
| Anti-IRF-3-full length | Actif motif | 39033 | Store aliquoted at -80oC. Avoid freeze/thaw. |
| Anti-IRF3-NES | IBL-America | 18781 | Store aliquoted at -20oC. |
| Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus | Perkin-Elmer Life Sciences | NEL104001EA | |
| LAS4000mini CCD camera apparatus | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range | Bio-Rad | 161-0317 | Store aliquoted at -20oC. |
Referencias
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