Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het chromatine immunoprecipitation van gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wordt vervolgens gebruikt voor kwantitatieve PCR te ondervragen de overvloed en lokalisatie van Histon posttranslationele modificaties in het genoom.
Abstract
Histon posttranslationele modificaties (PTMs), zoals acetylation, methylation en fosforylatie, worden dynamisch geregeld door een aantal enzymen die toevoegen of verwijderen van deze merken in reactie op signalen ontvangen door de cel. Deze PTMS zijn belangrijke bijdragen aan de regulatie van processen zoals gen expressie controle en reparatie van DNA. Immunoprecipitation (chIP) van de chromatine is een instrumentele aanpak voor het ontleden van de overvloed en lokalisatie van vele Histon PTMs in het genoom in reactie op diverse verstoringen naar de cel. Hier is een veelzijdige methode voor het uitvoeren van chIP van post-translationally gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) beschreven. Deze methode berust op crosslinking van eiwitten en DNA met behulp van formaldehyde behandeling van gist culturen, generatie van gist lysates door parel verslaan, solubilisatie van chromatine fragmenten door micrococcal nuclease en immunoprecipitation van Histon-DNA complexen. DNA die is gekoppeld aan het merk Histon van belang is gezuiverd en onderworpen aan kwantitatieve PCR analyse om te evalueren van de verrijking op meerdere loci gedurende het genoom. Representatieve experimenten sonderen de lokalisatie van de Histon merken H3K4me2 en H4K16ac in wildtype en mutant gist worden besproken om aan te tonen van data-analyse en interpretatie. Deze methode is geschikt voor een verscheidenheid van Histon PTMs en kan worden uitgevoerd met verschillende gemuteerde stammen of in de aanwezigheid van diverse milieu benadrukt, waardoor het een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van veranderingen in de dynamiek van de chromatine onder verschillende omstandigheden.
Introduction
De dynamische posttranslationele wijziging (PTM) van histones is een belangrijke regelgevende mechanisme voor vele DNA-templated processen, waaronder transcriptie, replicatie en DNA repair1,2. De mogelijkheid om de overvloed en precieze lokalisatie van gemodificeerde histonen gelijktijdig met deze processen is daarom cruciaal te begrijpen hun verordening onder verschillende omstandigheden in de cel. De ontwikkeling van chromatine immunoprecipitation (chIP) als een methode die grotendeels voortvloeide uit de biochemische studies van de interacties tussen eiwitten en DNA, met name in vitro methoden met behulp van chemische crosslinkers, in combinatie met de noodzaak om de dynamiek van eiwit-DNA interacties in vivo en in specifieke regio’s van het genoom3,4,5. De vooruitgang van kwantitatieve PCR (qPCR) en sequencing technologieën heeft ook uitgebreid de mogelijkheid om uit te voeren van de experimenten van de chIP met kwantitatieve vergelijkingen en over het geheel genomen, waardoor het een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van DNA-eiwit interactie op meerdere niveaus.
ChIP is momenteel een vereiste methode voor elke onderzoeksgroep kochten chromatine-gemedieerde regulering van het genoom zoals er geen vergelijkbare methoden zijn voor het rechtstreeks ondervragen van de fysieke verbinding tussen een gemodificeerde histone en een specifieke genomic locus in vivo. Hoewel er variaties van deze methode met behulp van de volgende generatie sequencing toewijzen histone modificaties gedurende de genoom6,7 beschikbaar zijn, kunnen deze benaderingen betrekking hebben op verschillende wetenschappelijke vragen en hun omvang, kosten en technische middelen kunnen worden beperkt voor sommige onderzoeksgroepen. Bovendien, gerichte chIP-qPCR is noodzakelijk als aanvulling op deze benaderingen door middel van methoden om beide te optimaliseren het chIP-protocol vóór sequencing en valideren van resultaten van de epigenomic datasets. Massaspectrometrie gebaseerde benaderingen voor de identificatie van de volledige aanvulling van Histon merken die zijn gekoppeld aan de genomic regio’s ook hebben ontstaan8,9,10,11, echter deze benaderingen hebben sommige beperkingen met betrekking tot die regio’s van het genoom kunnen worden bestudeerd en zij vereisen technische expertise en instrumentatie die niet beschikbaar voor alle onderzoeksgroepen is. ChIP blijft derhalve een fundamentele methode voor het analyseren van de omvang en de verdeling van Histon modificaties onder uiteenlopende omstandigheden voor alle onderzoeksgroepen kochten epigenetica, chromatine en de regeling van genomic functies.
Hier beschrijven we een methode voor chIP met behulp van de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) om te onderzoeken van de verdeling van Histon PTMs op chromatine model. Deze aanpak is afhankelijk van een aantal kernonderdelen van chIP protocollen ontwikkeld in gist en ook toegepast op uiteenlopende model systemen12,13. Interacties tussen gemodificeerde histonen en DNA in de cel worden bewaard door crosslinking met formaldehyde. Na de lysate bereiding, chromatine fragmenten zijn ontbindend in uniform en middelgrote fragmenten door spijsvertering met micrococcal nuclease. Immunoprecipitation van de gemodificeerde histonen is uitgevoerd met commerciële of lab-gegenereerd antilichamen en eventuele bijbehorende DNA is geïsoleerd en geanalyseerd voor verrijking op bepaalde genomic regio’s met behulp van qPCR (Figuur 1). Voor vele histone modificaties volstaat de hoeveelheid DNA die dit protocol verkregen voor het testen van meer dan 25 verschillende genomic loci door qPCR.
Deze chIP methode is zeer veelzijdig voor het toezicht op de verdeling van een enkele Histon wijziging op meerdere gemuteerde stammen of milieuomstandigheden, of voor het testen van meerdere histone modificaties in wildtype cellen bij een aantal genomic loci. Bovendien zijn talrijke onderdelen van het protocol gemakkelijk instelbaar tot opsporing van beide zeer – of nederig-overvloedig Histon merken optimaliseren. Ten slotte, uitvoeren van chIP van gemodificeerde histonen in ontluikende gist biedt de mogelijkheid om belangrijke besturingselementen gebruiken voor antilichamenspecificiteit die grotendeels niet beschikbaar zijn in andere systemen. Namelijk, giststammen kunnen worden gegenereerd die puntmutaties in Histon residuen die zijn gericht tot wijziging draagt, en, in sommige gevallen is er slechts een enkele enzym dat wijziging op een bepaalde Histon residu katalyseert (bv. Histon lysine methyltransferases). Daarom kan de chIP worden uitgevoerd in ofwel de Histon mutant of enzym schrapping stammen te assay de mate waarin niet-specifieke binding van het antilichaam kan worden voorkomen en het genereren van vals-positieve resultaten. Dit besturingselement is bijzonder waardevol voor nieuw ontwikkelde antilichamen, en kan zelfs worden gebruikt om te valideren antilichamenspecificiteit voor geconserveerde histone modificaties voorafgaand aan hun gebruik in andere systemen. Deze aanpak vormt een aanvulling op andere methoden om antilichamenspecificiteit test die onderscheid maken tussen verschillende wijziging Staten (zoals mono-, di- en tri-methylering), met inbegrip van sonderen matrices van gemodificeerde peptiden en uitvoeren van westelijke vlekken van histones of nucleosomes met gedefinieerde wijzigingen. Globaal, chIP in de ontluikende gist is een krachtige methode voor de beoordeling van de dynamiek van Histon PTMs in het genoom en het ontleden van de mechanismen inzake hun verordening.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven procedure zorgt voor de efficiënte herstel van DNA in verband met gewijzigde histonen in gistcellen door immunoprecipitation. Dit wordt gevolgd door de qPCR gebruikend inleidingen die nadere uitwerking van de regio’s van belang zijn voor het bepalen van de lokale verrijking of uitputting van specifieke histone modificaties. Ondanks de bijna twintig jaar geleden als een methode ontwikkeld, blijft chIP de bepalende assay voor het onderzoeken van de status van de wijziging van de Histon op verschillende …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank leden van de groene lab voor nuttige discussies. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de NIH R03AG052018 en R01GM124342 naar E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referencias
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3′-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
