Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di modificazioni istoniche da Saccharomyces cerevisiae
Summary
Qui, descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione della cromatina degli istoni modificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae. DNA immunoprecipitato viene successivamente utilizzato per PCR quantitativa per interrogare l’abbondanza e la localizzazione di modifiche post-traduzionali degli istoni in tutto il genoma.
Abstract
Modificazioni post-traduzionali degli istoni (PTM), quali acetilazione, metilazione e fosforilazione, sono regolate dinamicamente da una serie di enzimi che aggiungono o rimuovono questi segni in risposta ai segnali ricevuti dalla cellula. Questi PTMS sono contributori chiave per la regolazione di processi come controllo di espressione genica e di riparazione del DNA. Immunoprecipitazione della cromatina (chIP) è stato un approccio strumentale per l’abbondanza e la localizzazione di molti istone PTMs in tutto il genoma in risposta alle diverse perturbazioni alla cella di dissezione. Qui, un metodo versatile per l’esecuzione di chIP degli istoni traduzionalmente modificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) è descritto. Questo metodo si basa sulla reticolazione delle proteine e del DNA tramite trattamento di formaldeide delle colture di lievito, generazione di lisati di lievito da perlina battendo, solubilizzazione dei frammenti di cromatina di nucleasi di micrococcal e l’immunoprecipitazione di istone-DNA complessi. DNA associato con il contrassegno dell’istone di interesse è purificato e sottoposti ad analisi quantitativa di PCR per valutare il suo arricchimento a più luoghi in tutto il genoma. Rappresentante esperimenti sondando la localizzazione dei contrassegni dell’istone H3K4me2 e H4K16ac nel wildtype e lievito mutante sono discussi per dimostrare l’interpretazione e l’analisi dei dati. Questo metodo è adatto per una varietà di istone PTMs e può essere eseguito con diversi ceppi mutanti o in presenza di diversi stress ambientali, che lo rende un ottimo strumento per indagare i cambiamenti nella dinamica della cromatina in condizioni diverse.
Introduction
La modificazione post-traduzionale dinamico (PTM) degli istoni è un meccanismo normativo fondamentale per molti processi basati su modelli del DNA, compreso trascrizione, replicazione e riparazione del DNA1,2. La capacità di determinare l’abbondanza e la localizzazione precisa degli istoni modificati concomitanti con questi processi è quindi fondamentale per comprendere la loro regolazione in condizioni diverse nella cella. Lo sviluppo di immunoprecipitazione della cromatina (chIP) come metodo derivavano in gran parte da studi biochimici delle interazioni delle proteine con DNA, particolarmente in vitro metodi utilizzando reticolanti chimici, accoppiato con la necessità di valutare la natura dinamica delle interazioni proteina-DNA in vivo e in regioni specifiche del genoma3,4,5. L’avanzamento della PCR quantitativa (qPCR) e tecnologie di sequenziamento ha inoltre ampliato la possibilità di eseguire esperimenti di chIP con confronti quantitativi e attraverso interi genomi, che lo rende un potente strumento per dissezione interazioni della DNA-proteina a livelli multipli.
Attualmente, il chIP è un metodo richiesto per qualsiasi gruppo di ricerca interessato a regolazione della cromatina-mediata del genoma come non esistono metodi comparabili per interrogare direttamente il collegamento fisico tra un istone modificato e un locus genomico specifico in vivo. Anche se le varianti di questo metodo utilizzando il sequenziamento di nuova generazione per mappare le modifiche dell’istone in tutto il genoma6,7 sono disponibili, questi approcci possono riguardare diversi quesiti scientifici e loro scala, costo e risorse tecniche possono essere limitante per alcuni gruppi di ricerca. Inoltre, è necessario completare questi mirati chIP-qPCR approcci fornendo metodi ad entrambi ottimizzano il protocollo chIP prima del sequenziamento e per convalidare i risultati dei set di dati epigenomic. Spettrometria di massa basato su approcci per identificare la serie completa di istone marchi associati a regioni genomiche hanno anche emerso8,9,10,11, tuttavia, questi gli approcci hanno alcune limitazioni per quanto riguarda cui regioni del genoma possono essere sondate e richiedono competenze tecniche e la strumentazione che non sarà disponibile per tutti i gruppi di ricerca. Di conseguenza, chIP rimane un metodo fondamentale per analizzare l’abbondanza e la distribuzione delle modifiche dell’istone in condizioni diverse per tutti i gruppi di ricerca interessati a epigenetics, cromatina e regolazione delle funzioni genomiche.
Qui, descriviamo un metodo per modello chIP usando il lievito gemmante Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) per studiare la distribuzione delle istone PTMs a cromatina. Questo approccio si basa su una serie di componenti di base dei protocolli di chIP sviluppato in lievito e applicato anche al modello diversi sistemi12,13. Interazioni tra modificate gli istoni e il DNA nella cella sono conservate di reticolazione con formaldeide. Dopo la preparazione del lysate, frammenti di cromatina sono solubilizzati in frammenti di dimensioni medie uniformemente tramite digestione con nucleasi di micrococcal. Immunoprecipitazione degli istoni modificati è effettuato con gli anticorpi commerciali o laboratorio-generato e qualsiasi DNA associato è isolato e analizzato per arricchimento alle regioni genomiche particolare utilizzando qPCR (Figura 1). Per molte modificazioni istoniche, la quantità di DNA ottenuto da questo protocollo è sufficiente per il test più di 25 differenti loci genomici qPCR.
Questo metodo di chIP è altamente versatile per monitorare la distribuzione di una modifica dell’istone singolo attraverso diversi ceppi mutanti o condizioni ambientali, o per le prove multiple modificazioni istoniche in wildtype cellule in un certo numero di loci genomici. Inoltre, numerosi componenti del protocollo sono facilmente regolabili per ottimizzare il rilevamento di entrambi altamente – o umili-abbondante contrassegni dell’istone. Infine, esecuzione di chIP degli istoni modificati nel lievito gemmante offre l’opportunità di utilizzare controlli essenziali per la specificità dell’anticorpo in gran parte non disponibili in altri sistemi. Vale a dire, ceppi di lievito possono essere generati che portano mutazioni puntiformi nei residui di istone che sono mirati per la modifica, e, in alcuni casi, c’è solo un singolo enzima che catalizza la seguente modifica su un residuo di istone particolare (ad es. lisina dell’istone methyltransferases). Di conseguenza, chIP può essere eseguita in entrambi l’istone mutante o enzima eliminazione ceppi di saggiare la misura in cui legame non specifico dell’anticorpo può essere che si verificano e generare falsi positivi. Questo controllo è particolarmente prezioso per gli anticorpi di nuova concezione e può anche essere utilizzato per convalidare la specificità dell’anticorpo per le modifiche dell’istone conservati prima del loro utilizzo in altri sistemi. Questo approccio si integra con altri metodi per verificare la specificità dell’anticorpo che distinguono tra Stati di diverse modifiche (ad esempio mono-, di – e tri-metilazione), tra cui matrici di peptidi modificati di sondaggio e l’esecuzione di western blot degli istoni o nucleosomi con modifiche definite. Nel complesso, il chIP nel lievito gemmante è un potente metodo per valutare le dinamiche dell’istone PTMs in tutto il genoma e meccanismi che governano il loro regolamento di dissezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura qui descritta consente il recupero efficiente di DNA associato a istoni modificati in cellule di lievito mediante immunoprecipitazione. Questa è seguita da qPCR utilizzando primers che amplificare regioni di interesse determinare arricchimento locale o esaurimento delle modificazioni istoniche specifici. Nonostante essere sviluppato come un metodo quasi 20 anni fa, chIP rimane la definizione per indagare lo stato di modifica dell’istone alle differenti regioni genomiche e in condizioni diverse. Anche se il …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare i membri del laboratorio verde per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH R03AG052018 e R01GM124342 per E.M.G
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referencias
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