酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)
Summary
ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR 豊かさとゲノム全体ヒストン翻訳後修飾のローカリゼーションを調査する使用されます。
Abstract
アセチル化、メチル化、リン酸化などの翻訳後修飾ヒストン修飾 (Ptm) は、一連のセルによって受信した信号への応答でこれらのマークの削除を追加または酵素によって動的に調整されます。これらの PTM が遺伝子発現制御などのプロセスの規則への主貢献者および DNA 修復します。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、豊かさとセルに多様な摂動に対してゲノム全体にわたって多くのヒストン Ptm のローカリゼーションを解剖するため手段アプローチをされています。ここでは、出芽酵母酵母 (出芽酵母)からファーストクリーニング変更されたヒストンのチップを実行するための汎用性の高いメソッドを説明します。このメソッドはホルムアルデヒド治療イースト文化の DNA やタンパク質の架橋結合に依存しているミクロコッカスヌクレアーゼ、によってクロマチン フラグメントの可溶化とヒストン DNA の免疫沈降を破って、ビーズで酵母溶解液の生成複合体。興味のヒストン マークに関連付けられている DNA は、精製は、ゲノム全体の複数の座位で濃縮を評価する定量的 PCR 分析を受けます。野生型と変異酵母ヒストン マーク H3K4me2 と H4K16ac の局在化を探る代表的な実験、データ分析と解釈を示す説明します。このメソッドは、さまざまなヒストン Ptm に適していて、異なる突然変異系統またはそれに異なる条件下でのクロマチン動態の変化を調査するための優れたツールを作り、多様な環境ストレスの存在下で実行できます。
Introduction
ヒストンの動的の翻訳後修飾 (PTM) は、転写、複製、DNA 修復1,2を含む多くの dna のプロセスに対して重要な規制メカニズムです。豊かさと変更されたヒストン併用、これらのプロセスの正確な局在を決定する機能がセルに異なる条件の下で、規制を理解したがって欠かせません。主茎では、DNA 蛋白質の相互作用の生化学的研究から特に体外法化学塗料の硬化剤、方法としてクロマチン免疫沈降 (チップ) の開発を評価する必要性と相まって、蛋白質 DNA 相互作用の体内とゲノム3,4、5の特定の領域での動的な性質。(QPCR) の量的な PCR とシーケンス テクノロジーの進歩もチップ実験で DNA 蛋白質の相互作用を解剖するための強力なツールとなって全体のゲノムの定量的な比較を実行する能力を拡大しています。複数のレベル。
現在、チップはゲノムのクロマチン パミンに興味を持って、研究グループの必要なメソッドとして変更されたヒストンおよび特定の genomic 位置の間で物理リンクに直接問い合わせることに匹敵するメソッドがないです。vivo。さまざまな科学的な質問の規模、コスト、これらのアプローチがアドレスがありますゲノム6,7中のヒストンの修正をマップする次世代シーケンシングを使用してこのメソッドのバリエーションはありますが、テクニカル リソースは、いくつかの研究グループの制限があります。さらに、対象となるチップ qPCR はこれらを補完するために必要な方法で両方を提供することによってアプローチを最適化チップ プロトコル シーケンスの前に、エピゲノムのデータセットの結果を検証します。質量分析法に基づくアプローチ8,9,10,11, をただし、浮上してもゲノム領域に関連付けられているマークがあるヒストンの完全な補完を識別するこれらアプローチに関するゲノムの領域を検出できる、技術的な専門知識と研究のすべてのグループに使用できなくなります計装を必要といくつかの制限があります。したがって、チップは豊かさとエピジェネティクス、クロマチンとゲノム機能の制御に興味があるすべての研究グループの多様な条件下でのヒストンの修正の分布を分析するための基本メソッドです。
ここでは、出芽酵母を用いたチップ モデル酵母 (出芽酵母)クロマチンでヒストン Ptm の分布を調査する手法について述べる。このアプローチは、酵母を開発し、多様なモデル システム12,13にも適用チップ プロトコルのコア コンポーネントの数に依存します。変更されたヒストンと DNA、細胞間の相互作用は、ホルムアルデヒドで架橋によって保持されます。次の試薬、クロマチン フラグメントによって可溶性に均一サイズの断片にミクロコッカスヌクレアーゼで消化。商業やラボで生成された抗体、変更されたヒストンの免疫沈降を実行され、任意の関連付けられた DNA を分離して、qPCR (図 1) を使用して特定のゲノム領域で濃縮を分析します。多くのヒストンの修正、この議定書から得られた DNA の量は qPCR で 25 以上の異なるゲノム遺伝子をテストするため十分です。
このチップ メソッドは、汎用性の高い複数の変異株や環境条件は、1 つのヒストン修飾の分布を監視または野生型細胞ゲノムの遺伝子の数で複数のヒストンの修正をテストするためです。さらに、プロトコルの多数のコンポーネントは、いずれか高いまたは卑しい-豊富なヒストンの検知を最適化するために容易に調節可能。最後に、出芽酵母で変更されたヒストンのチップを実行する他のシステムで主に使用される抗体の特異性の主要なコントロールを使用する機会を提供します。すなわち、酵母に変更、対象とヒストンの残基の点突然変異を運ぶ生成され、いくつかのケースでは、のみ特定のヒストン残渣の変更を促進する単一酵素 (e.gヒストンのリジン。メチル化酵素)。したがって、チップは、いずれか、ヒストン変異体や酵素削除系統程度抗体の非特異的結合が発生して偽陽性の結果を生成する可能性がありますを試金する実行できます。このコントロールは、新しく開発された抗体、特に貴重なも他のシステムで、使用前に保存されたヒストン修飾の抗体の特異性を検証に使用することがあります。このアプローチは、(モノ-、ジ -、tri-メチル化) などの別の修正状態の間で区別する抗体の特異性をテストするのには他の方法を補完する変更されたペプチドの配列をプローブとヒストンの西部のしみの実行を含むまたは定義された変更とヌクレオソーム。全体的にみて、出芽酵母におけるチップはヒストン Ptm ゲノム全体のダイナミクスを評価して、その調節を支配するメカニズムを解剖する有力な手法であります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明したプロシージャ免疫沈降による酵母細胞の変更されたヒストンに関連付けられている DNA の効率的な復旧できます。これはローカル濃縮を決定する対象領域または特定のヒストンの修正の枯渇を増幅するプライマーを使用して qPCR が続きます。ほぼ 20 年前メソッドとして開発されているにもかかわらずチップのまま異なるゲノム領域で、多様な条件下でのヒストン変更状態を調?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、役に立つ議論のため緑のラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、NIH の補助金 R03AG052018 と E.M.G. に R01GM124342 によって部分で支えられました
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referencias
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