Иммунопреципитации Chromatin (чип) изменения гистона от Saccharomyces cerevisiae
Summary
Здесь мы описываем протокол для иммунопреципитации chromatin о модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ДНК впоследствии используется для количественного PCR допросить изобилия и локализации столб-поступательные изменения гистона на протяжении всего генома.
Abstract
Столб-поступательные изменения гистона (PTMs), такие как ацетилирования, метилирование и фосфорилирования, динамически регулируется ряд ферментов, которые добавить или удалить эти знаки в ответ на сигналы, полученные в ячейке. Эти PTMS являются важнейшими действующими лицами для регулирования процессов таких как выражение гена управления и ремонта ДНК. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) был инструментальный подход для рассечения изобилия и локализации многих гистона PTMs на протяжении всего генома в ответ на разнообразные возмущений в ячейку. Здесь описан универсальный способ выполнения чип post-translationally модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Этот метод полагается на сшивки белков и ДНК, используя формальдегида лечения дрожжевых культур, поколение лизатов дрожжей, бисера, избиение, солюбилизация фрагментов хроматина, Микрококковая Нуклеаза и иммунопреципитации гистон-ДНК комплексы. ДНК, связанные с гистонов Марк интерес очищается и подвергается количественной ПЦР-анализа для оценки ее обогащения на нескольких локусов на протяжении всего генома. Представитель эксперименты зондирующего локализация меток гистона H3K4me2 и H4K16ac в wildtype и мутанта дрожжей обсуждаются продемонстрировать анализа и интерпретации данных. Этот метод подходит для различных гистона PTMs и может выполняться с различными мутантных штаммов или в присутствии различных экологических подчеркивает, что делает его отличным инструментом для изучения изменений в динамике хроматина в различных условиях.
Introduction
Динамического столб-поступательные изменения гистонов (ПТМ) является ключевым механизмом регулирования для многих ДНК шаблонного процессов, в том числе транскрипции и репликации ДНК ремонт1,2. Возможность определить изобилие и точной локализации модифицированных гистонами сочетанной с этими процессами таким образом имеет решающее значение для понимания их регулирования в различных условиях в ячейке. Развитие иммунопреципитации chromatin (обломока) как метод, во многом обусловлены биохимических исследований взаимодействия белков с ДНК, особенно в vitro методы с использованием химических сшиватели, наряду с необходимостью оценки Динамическая природа ДНК белковых взаимодействий в естественных условиях и в отдельных регионах генома3,4,5. Улучшения количественного PCR (ПЦР) и технологий виртуализации также расширил возможность выполнения чип эксперименты с количественных сопоставлениях и через весь геном, что делает его мощным инструментом для рассечения ДНК белковых взаимодействий на несколько уровней.
В настоящее время чип является необходимый метод для любой исследовательской группы заинтересованы в хроматина опосредованное регулирование генома, как есть без сопоставимых методов непосредственно допроса физической связи между изменение гистона и конкретных геномной Локус в VIVO. Хотя имеются вариации этого метода, с помощью следующего поколения последовательности для сопоставления изменения гистона на протяжении всего генома6,7 , эти подходы могут обращаться различные научные вопросы и их масштаба, стоимость и технические ресурсы могут ограничения для некоторых исследовательских групп. Кроме того, целевые чип ПЦР необходимых для дополнения этих подходов, предоставляя методы как оптимизировать чип протокола до начала последовательности и проверить результаты от epigenomic наборов данных. Масс-спектрометрия основанные подходы для выявления бессепараторные гистонов, марки, связанные с геномной регионы имеют также появились8,9,10,11, однако, эти подходы имеют некоторые ограничения относительно того, какие регионы генома может быть исследован и они требуют технических знаний и инструментария, которые не будут доступны для всех исследовательских групп. Таким образом чип остается основополагающий метод для анализа изобилия и распределение изменения гистона при различных условиях для всех исследовательских групп, заинтересованных в эпигенетики, хроматина и регулирование геномной функций.
Здесь мы описываем метод чип с использованием дрожжей начинающих модель Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) для изучения распределения гистона PTMs на хроматина. Этот подход основывается на ряде ключевых компонентов чип протоколов, разработанных в дрожжей и применяется также к разнообразной модели систем12,13. Взаимодействие между ДНК в клетке и модифицированных гистонами сохраняются сшивки с формальдегидом. После lysate подготовки хроматина фрагменты являются солюбилизирован в равномерно размера фрагментов, пищеварение с Микрококковая нуклеиназы. Иммунопреципитация модифицированных гистонами выполняется с коммерческой или генерируемые лаборатории антител и любые связанные ДНК изолирована и проанализированы для обогащения в конкретных регионах геномной, с помощью ПЦР (рис. 1). Для многих гистона модификаций количество ДНК, полученных из настоящего Протокола является достаточным для тестирования более чем 25 различных локусов генома, ПЦР.
Этот метод чип универсальный для контроля за распределением одного гистона модификации нескольких мутантных штаммов или условий окружающей среды, или для тестирования нескольких изменения гистона wildtype клеток на количество локусов генома. Кроме того многочисленные компоненты протокола легко регулируемая оптимизировать обнаружение либо высоко – или смирен обильные меток гистона. Наконец выполняя чип модифицированных гистонов в многообещающий дрожжей обеспечивает возможность использования ключевых элементов для специфичность антитела, которые в основном недоступны в других системах. А именно, штаммов дрожжей могут быть созданы, которые носят точечные мутации в гистона остатков, которые предназначены для изменения, и, в некоторых случаях, есть только один фермент, который катализирует модификации на конкретной гистона остатков (например. лизин гистона methyltransferases). Таким образом чип может выполняться либо гистона мутанта или фермента удаления штаммов для анализа степени неспецифической Связывание антитела могут происходящих и генерации ложных положительных результатов. Этот элемент управления является особенно ценным для разработанной антител и даже могут быть использованы для проверки специфичность антитела для изменения гистона сохраняется до их использования в других системах. Этот подход дополняет другие методы для тестирования специфичность антитела, которые отличают между государствами различных изменений (таких как моно-, ди – и tri метилирование), включая зондирующего массивы модифицированных пептидов и выполнение западных помарках гистонами или нуклеосом с определенными изменениями. В целом чип в многообещающий дрожжей является мощный метод для оценки динамики гистона PTMs на протяжении всего генома и пройдя через механизмы, регулирующие их регулирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процедура, описанная здесь позволяет для эффективного восстановления ДНК, связанные с гистонами изменение в клетках дрожжей по иммунопреципитации. Это сопровождается ПЦР с праймерами, которые усиливают областей, представляющих интерес для определения местных обогащения или истощен?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить членов зеленый лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа частично поддержали NIH грантов R03AG052018 и R01GM124342 для E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referencias
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3′-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
