Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour l’immunoprécipitation de la chromatine des histones modifiées de la levure Saccharomyces cerevisiae. ADN immunoprécipitée est ensuite utilisé pour la PCR quantitative pour interroger l’abondance et la localisation des modifications post-traductionnelles des histones dans tout le génome.
Abstract
Dynamiquement, modifications post-traductionnelles des histones (MEA), tels que l’acétylation, méthylation et phosphorylation, sont régies par une série d’enzymes permettant d’ajouter ou de supprimer ces marques en réponse aux signaux reçus par la cellule. Ces SPTM est les principaux contributeurs à la régulation des processus tels que le contrôle d’expression de gène et de réparation de l’ADN. Immunoprécipitation de la chromatine (chIP) a été une approche instrumentale pour disséquer l’abondance et la localisation de nombreux SPTM histone dans tout le génome en réponse aux perturbations diverses à la cellule. Ici, on décrit une méthode polyvalente permettant d’effectuer la puce des histones modifiées post-traductionnellement de la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Cette méthode s’appuie sur la réticulation des protéines et l’ADN à l’aide de traitement de formaldéhyde des cultures de levures, génération de lysats de levure par perle battant, la solubilisation des fragments de chromatine par nucléase micrococcique et immunoprécipitation d’ADN-histones complexes. ADN, associée à la marque d’histone d’intérêt est purifié et soumis à l’analyse PCR quantitative pour évaluer son enrichissement à plusieurs loci dans tout le génome. Des expériences représentatives sonder la localisation des marques histone H3K4me2 et H4K16ac dans le type sauvage et levure mutante sont discutés pour démontrer l’interprétation et l’analyse des données. Cette méthode convient à une variété de l’histone SPTM et peut être effectuée avec différentes souches mutantes ou en présence de diverses contraintes environnementales, ce qui en fait un excellent outil pour l’étude des changements dans la dynamique de la chromatine dans des conditions différentes.
Introduction
La modification post-traductionnelle dynamique (PTM) des histones est un mécanisme réglementaire clé pour de nombreux processus basé sur un modèle ADN, y compris la transcription, de réplication et de réparation de l’ADN1,2. La capacité de déterminer l’abondance et la localisation précise des histones modifiées concomitantes avec ces processus est donc essentielle pour comprendre leur régulation dans des conditions différentes dans la cellule. Le développement de l’immunoprécipitation de la chromatine (chIP) comme une méthode largement découlé des études biochimiques des interactions des protéines avec de l’ADN, notamment en vitro méthodes à l’aide d’agents réticulants chimiques, conjuguée à la nécessité d’évaluer la nature dynamique des interactions protéine-ADN in vivo et à des régions spécifiques du génome3,4,5. L’avancement des technologies de séquençage et de PCR quantitative (qPCR) a également développé la capacité d’effectuer des expériences de puce avec des comparaisons quantitatives et à travers des génomes entiers, ce qui en fait un outil puissant pour disséquer les interactions ADN-protéines à plusieurs niveaux.
Actuellement, la puce est une méthode obligatoire pour tout groupe de recherche intéressé par la chromatine-régulation du génome qu’il ne sont a pas de méthodes comparables pour interroger directement le lien physique entre une histone modifié et un locus génomique spécifique dans vivo. Bien qu’il existent des variantes de cette méthode à l’aide de séquençage de la génération suivant pour mapper les modifications d’histone dans tout le génome6,7 , ces approches peuvent aborder différentes questions scientifiques et leur échelle, les coûts et ressources techniques peuvent être limitée pour certains groupes de recherche. En outre, puce-qPCR ciblée est nécessaire pour compléter ces approches en fournissant des méthodes à la fois optimiser le protocole puce avant de séquençage et de valider les résultats de l’épigénomique datasets. Approches fondées sur la spectrométrie de masse pour déterminer l’effectif complet de l’histone marques associées aux régions génomiques ont également émergé8,9,10,11, cependant, ces approches ont certaines limites concernant les régions du génome peuvent être sondées et dont ils ont besoin de compétences techniques et l’instrumentation qui ne seront pas disponible pour tous les groupes de recherche. Par conséquent, la puce reste une méthode fondamentale pour analyser l’abondance et la distribution des modifications d’histone dans des conditions diverses pour tous les groupes de recherche intéressés de l’épigénétique, la chromatine et la régulation des fonctions génomiques.
Nous décrivons ici une méthode pour modèle de puce à l’aide de la levure de bière Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) pour étudier la distribution des histones SPTM à la chromatine. Cette approche s’appuie sur un certain nombre d’éléments de base des protocoles de puce développée chez la levure et également appliquées au modèle divers systèmes12,13. Interactions entre les histones modifiées et de l’ADN dans la cellule sont conservées par réticulation avec le formaldéhyde. Après préparation de lysate, fragments de la chromatine sont solubilisées en fragments de taille uniforme par digestion avec la nucléase micrococcique. Immunoprécipitation des histones modifiées est réalisée avec des anticorps soit commerciales soit généré par lab et tout associé à l’ADN est isolé et analysé pour enrichissement à certaines régions génomiques à l’aide de qPCR (Figure 1). De nombreuses modifications d’histone, la quantité d’ADN obtenu à partir de ce protocole est suffisante pour les essais de plus de 25 différents locus génomiques par qPCR.
Cette méthode de puce est très polyvalente pour surveiller la distribution d’une modification des histones unique en plusieurs souches mutantes ou les conditions environnementales, ou pour les tests multiples modifications d’histone dans les cellules de type sauvage à un certain nombre de locus génomiques. En outre, de nombreuses composantes du protocole sont facilement réglables pour optimiser la détection des deux marques histone fortement ou faiblement-abondantes. Enfin, effectuer la puce des histones modifiées dans la levure de bière offre la possibilité d’utiliser des contrôles clés pour la spécificité de l’anticorps qui sont en grande partie non disponible dans d’autres systèmes. À savoir, souches de levure peuvent être générés qui portent des mutations ponctuelles dans les résidus d’histones qui sont visés par la modification, et, dans certains cas, il n’y a seulement une seule enzyme qui catalyse la modification sur un résidu d’histone particulière (par exemple. lysine histone méthyltransférases). Par conséquent, puce peut être effectuée soit l’histone mutant ou enzyme suppression souches d’analyser la mesure dans laquelle liaison non spécifique de l’anticorps peut être survenus et générant des résultats faussement positifs. Ce contrôle est particulièrement utile pour les anticorps nouvellement développé et peut même être utilisé pour valider la spécificité de l’anticorps pour des modifications d’histone conservée avant des utiliser dans d’autres systèmes. Cette approche vient compléter d’autres méthodes pour tester la spécificité des anticorps qui permettent de distinguer entre les États de modification différents (tels que les mono-, di – et tri-méthylation), y compris les tableaux de peptides modifiés de palpage et effectuer des transferts western des histones ou nucléosomes avec modifications déterminées. Dans l’ensemble, la puce dans la levure de bière est une méthode puissante pour évaluer la dynamique de l’histone SPTM dans tout le génome et disséquer les mécanismes régissant leur règlement.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure décrite ici permet la récupération efficace des ADN associé à des histones modifiées dans les cellules de levure par immunoprécipitation. Elle est suivie de qPCR en utilisant des amorces qui amplifient des régions d’intérêt pour déterminer un enrichissement local ou l’appauvrissement des modifications des histones spécifiques. En dépit d’être mis au point il y a près de 20 ans, puce reste le test décisif pour enquêter sur le statut de modification des histones à différentes régions…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire vert pour discussions utiles. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions NIH R03AG052018 et R01GM124342 à E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referencias
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