Un protocole en vue d’acquérir la Tenocyte dégénérative de l’homme
Summary
In vitro utilisation de tenocytes dégénérative est essentielle lors d’enquêtes sur l’efficacité de nouveaux traitements sur tendinopathie. Toutefois, la plupart des études de recherche utilisent uniquement le modèle animal ou un tenocyte sain. Nous proposons le protocole suivant pour isoler tenocytes dégénératives humaines pendant la chirurgie.
Abstract
Tendinopathie, une affection douloureuse qui se développe en réponse à la dégénérescence du tendon, est en hausse dans les pays développés en raison de l’augmentation de l’activité physique et l’espérance de vie. Malgré l’augmentation de la prévalence, la pathogénie sous-jacente reste encore incertaine, et le traitement est généralement symptomatique. Récemment, de nombreuses options thérapeutiques, y compris les facteurs de croissance, les cellules souches et thérapie génique, ont été étudiées dans l’espoir d’améliorer la puissance de guérison du tendon dégénératif. Cependant, la majorité de ces études ont été menée que sur des modèles animaux ou tenocytes humain sain. Malgré certaines études sur le tenocytes pathologique, au meilleur de notre connaissance il n’y a actuellement aucun protocole décrivant comment obtenir tenocytes dégénératives humaines. Le but de cette étude est de décrire un protocole standard pour l’acquisition humaine tenocytes dégénérative. Au départ, le tissu tendineux a été récolté chez un patient présentant l’epicondylitis pendant la chirurgie. Puis biopsies ont été prises depuis le tendon extenseur carpi radialis brevis correspondant aux changements structurels observées au moment de la chirurgie. Tous les tendons récoltés semblent terne, gris et friable, et oedémateux, qui fait visuellement distinctes de celles en bonne santé. Tenocytes ont été cultivés et utilisés pour des expériences. Pendant ce temps, la moitié des tissus récoltés ont été analysée sur le plan histologique, et il a été démontré qu’ils partageaient les mêmes caractéristiques principales de tendinopathie (angiofibroblastic dysplasie ou hyperplasie). Une analyse secondaire par immunocytochimie a confirmé que les cellules cultivées ont été tenocytes avec la majorité des cellules ayant des taches positives pour les protéines mohawk et tenomodulin. Puis, les qualités de la nature dégénérative de tenocytes ont été déterminées en comparant les cellules avec le contrôle sain à l’aide d’une analyse de prolifération ou qRT-PCR. Le tenocyte dégénérative affiche un taux plus élevé de prolifération et similaires modèles d’expression de gène de tendinopathie correspondant à des rapports antérieurs. Dans l’ensemble, ce nouveau protocole pourrait constituer un outil utile pour les études futures de tendinopathie.
Introduction
Tendinopathie est un trouble musculo-squelettique dégénératif chronique qui se développe dans différentes parties du corps. Récemment, le nombre de cas de tendinopathie a augmenté considérablement dans les pays développés en raison de la participation aux sports de loisirs et l’espérance de vie accrue1,2de plus en plus. La cause de tendinopathie est considérée comme multifactorielle et ces causes incluent l’ischémie, blessures de radicaux libres d’oxygène, un déséquilibre entre les innervations vasoconstricteur et vasodilatateur, intérieur micro-déchire et modifications neuro-règlement3 ,4,5,6,7,8. La plupart des traitements pour tendinopathie seulement soulagent ses symptômes. En outre, traitements sans régénération tissulaire nécessitent une longue période de réadaptation et d’atteindre une réponse limitée de tendons blessés, qui impose un défi clinique pour médecins9.
L’incompétence des options thérapeutiques actuelles ainsi que le manque de capacité de tendon dégénératif d’auto-guérison a plomb chercheurs à s’intéresser à étudier les stratégies de traitement alternatif. Récemment, de nouvelles études ont signalé plusieurs des résultats prometteurs pour améliorer l’efficacité de guérison des tendons tendinopathie à l’aide de facteurs de croissance, base de cellules souches thérapie et thérapie de gène pour10,11,12.
À travers une revue de la littérature, nous avons constaté que les études concernées peuvent se diviser en deux catégories selon leur matériel d’analyse : modèles animaux comme un rat, une souris ou un lapin ; et des modèles humains. En ce qui concerne le modèle animal, il y a actuellement deux techniques populaires pour générer la tendinopathie : induction chimique de blessures ou de surcharger le modèle de mécanique. Toutefois, chaque modèle animal a été limitée dans la reproduction de la tendinopathie humain complexe pathologie13,14.
Plupart des papiers à l’aide d’échantillons humains étaient analysés sur le plan histologique ou effectuée l’ in vitro expérience basée sur un tenocyte humain sain au lieu d’une tenocyte dégénérative15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. seulement quelques papiers a signalé qu’ils ont utilisé un humain tenocyte dégénérative, mais ils n’a pas décrit en détail le protocole utilisé pour obtenir le tenocyte dégénérative de l’ humain22,23. Dans ce contexte, il convient de noter que des résultats positifs de la modèle animal ou le tissu sain/tenocyte peuvent prédire pas nécessairement efficacité humaine ou un dosage efficace parce que la dégénérescence du tendon est un processus compliqué et la pathogenèse pas encore pleinement compris.
Collectivement, il est nécessaire de décrire le protocole standard pour l’obtention de la tenocyte dégénérative de tissus humains sans provoquer d’effets indésirables pour le donateur. Cet article décrit un protocole sur la façon d’acquérir la tenocyte dégénérative humaine. Pour valider le protocole, les tissus récoltés ont été analysés sur le plan histologique. Puis, les cellules cultivées a été confirmé comme le tenocyte dégénérative en utilisant immunocytochimie (ICC), une réaction en chaîne en temps réel-polymérase quantitative (qRT-PCR) et une analyse de la viabilité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un certain nombre d’études antérieures ont rapporté comment créer des modèles animaux de tendinopathic chronique en utilisant différentes procédures telles que la collagénase ou injection de kartogenin, sur tapis roulant et plus de26,27. Bien que de nombreuses études ont montré des effets thérapeutiques prometteuses basées sur ces modèles animaux, expériences utilisant le tenocyte dégénérative humaine serait cruciales dans le domaine de la tend…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par une subvention de la Corée Health Technology R & D Project à travers la Corée santé Industrie développement Institut (KHIDI), qui a été financé par le ministère de la santé et le bien-être, la République de Corée (numéro de licence : HI16C1559).
Materials
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| Collagenase Ⅱ | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
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