Протокол для приобретения дегенеративные Tenocyte от людей
Summary
В vitro использование дегенеративные tenocytes имеет важное значение при исследовании эффективности Роман лечения на плеча. Однако большинство исследований использовать только животную модель или здорового tenocyte. Мы предлагаем следующий протокол изолировать человека дегенеративных tenocytes во время операции.
Abstract
Плеча, болезненное состояние, которое развивается в ответ на сухожилие дегенерации, находится на подъеме в развитых странах за счет увеличения физической активности и продолжительности жизни. Несмотря на его рост распространенности основной патогенез до сих пор остается неясным, и как правило симптоматическое лечение. Недавно многочисленные лечебные варианты, включая факторы роста, стволовых клеток и генной терапии, были расследованы надежде повышения исцеления потенции дегенеративных сухожилия. Однако большинство из этих исследований были проведены только на животных моделях или здорового человека tenocytes. Несмотря на некоторые исследования, используя патологических tenocytes в меру наших знаний существует в настоящее время протокол не описывается получение человека дегенеративных tenocytes. Цель этого исследования заключается в описывают стандартный протокол для получения человека дегенеративных tenocytes. Первоначально сухожильных тканей было собрано от пациента с боковой эпикондилит во время операции. Затем образцы биопсии были взяты из Карпи разгибателей запястья лучевой brevis сухожилие соответствующие структурные изменения, наблюдаемые во время хирургии. Все собранные сухожилий, как представляется, быть скучный, серый, рыхлая, и отечной, который делает их визуально отличаются от здоровыми. Tenocytes были культивировали и использоваться для экспериментов. Тем временем половина заготовленной тканей были проанализированы гистологически, и было показано, что они разделяют те же основные функции плеча (angiofibroblastic дисплазии или гиперплазия). Вторичный анализ immunocytochemistry подтвердил, что клетки культивировали tenocytes с большинством ячейки, имеющие позитивные пятна mohawk и tenomodulin белков. Качества дегенеративный характер tenocytes были затем определяется путем сравнения клетки с здорового управления, с помощью анализа распространения или qRT-PCR. Дегенеративных tenocyte отображается более высокий уровень распространения и подобных картин выражения гена из плеча, совпадающий с предыдущих докладах. В целом этот новый протокол может стать полезным инструментом для будущих исследований плеча.
Introduction
Плеча является хронические дегенеративные опорно-условие, которое развивается в различных частях тела. В последнее время значительно возросло количество случаев плеча в развитых странах из-за растущего участия в рекреационных видов спорта и увеличение продолжительности жизни1,2. Считается, что причиной плеча многофакторных и эти причины включают ишемию, травмы свободных радикалов кислорода, дисбаланс между сосудосуживающие и сосудорасширяющим иннервации, внутренней микро слезы и изменения в нейро регулирование3 ,4,5,6,,78. Большинство методов лечения для плеча только уменьшить ее симптомы. Кроме того лечение без регенерации тканей требуют много времени для реабилитации и достижения ограниченный отклик от потерпевшего сухожилий, который вводит клинической проблемой для врачей9.
Некомпетентность текущих вариантов лечения наряду с отсутствием дегенеративных сухожилия способность self-heal имеет ведущих исследователей взять интерес к изучению стратегий альтернативного лечения. Недавно новые исследования сообщили многие многообещающие результаты для повышения эффективности лечения сухожилий плеча, с использованием факторов роста, стволовой терапии и генной терапии10,,1112.
Через обзор литературы, мы обнаружили, что участие исследований можно разделить на две категории, на основании их анализа материалов: животных моделей как крыса, мышь или кролика; и человека модели. Что касается модели на животных, в настоящее время существует два популярных методов для создания плеча: химической индукции травмы или механические перегрузки модель. Однако каждое животное модель была ограничена в воспроизведении сложных человеческих плеча патологии13,14.
Большинство работ с использованием человеческих образцов были проанализированы гистологически или в пробирке эксперимент, основанный на здорового человека tenocyte вместо дегенеративные tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. лишь несколько документов сообщили, что они использовали человека дегенеративных tenocyte, но они не описывают в деталях протокол, используемый для получения дегенеративные tenocyte от человека22,23. В этом контексте следует отметить, что успешные результаты от животной модели или здоровые ткани/tenocyte не может предсказать обязательно, человека эффективность или эффективных дозирования, потому что сухожилия дегенерации является сложным процессом и является патогенеза еще не полностью изучены.
Коллективно необходимо описать стандартный протокол для получения дегенеративные tenocyte из тканей человека не вызывая отрицательные последствия для донора. Эта статья описывает протокол о том, как приобрести человека дегенеративных tenocyte. Чтобы проверить протокол, были проанализированы гистологически заготовленной тканей. Затем культивируемых клеток было подтверждено дегенеративные tenocyte с помощью immunocytochemistry (ICC), количественные реального времени полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) и жизнеспособности assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ряд предыдущих исследований сообщили как создать хронический tendinopathic животных моделей с использованием различных процедур, таких как коллагеназы или инъекций kartogenin, беговая дорожка работает и более26,27. Несмотря на многочисленные исследования показали …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грант от Кореи медицинских технологий R & D проекта через Корея здравоохранения промышленности развития института (ХИДИ), который финансируется министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (номер гранта: HI16C1559).
Materials
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| Collagenase Ⅱ | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
Referencias
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J. Models for the study of tendinopathy. Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes’ patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), 1359-1360 (2009).
