Un protocollo per acquisire il Tenocyte degenerativa dagli esseri umani
Summary
Uso in vitro di tenociti degenerativa è essenziale quando indagare l’efficacia del trattamento novello su tendinopathy. Tuttavia, molti studi di ricerca utilizzano solo il modello animale o un sano tenocyte. Vi proponiamo il seguente protocollo per isolare tenociti degenerativa umana durante la chirurgia.
Abstract
Tendinopatie, una condizione dolorosa che si sviluppa in risposta alla degenerazione del tendine, sono in aumento nei paesi industrializzati a causa della crescente attività fisica e maggiore aspettativa di vita. Nonostante la sua prevalenza aumentante, la patogenesi di fondo rimane ancora poco chiara, e il trattamento è generalmente sintomatico. Recentemente, numerose opzioni terapeutiche, tra cui fattori di crescita, cellule staminali e terapia genica, sono state studiate nella speranza di migliorare la potenza di guarigione del tendine degenerante. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono stati condotti solo su modelli animali o tenociti umano sano. Nonostante alcuni studi utilizzando tenociti patologiche, al meglio della nostra conoscenza non c’è attualmente nessun protocollo che descrive come ottenere umano tenociti degenerativa. Lo scopo di questo studio è di descrivere un protocollo standard per l’acquisizione di tenociti degenerativa umana. Inizialmente, il tessuto del tendine è stato raccolto da un paziente con epicondilite laterale durante la chirurgia. Quindi i campioni di biopsia sono stati prelevati il tendine di brevis radialis dei carpi dell’estensore corrispondenti ai cambiamenti strutturali osservati al momento della chirurgia. Tutti i tendini raccolti è sembrato essere opaco, grigio, friabile ed edematosa, che li ha resi visivamente distinta da quelle sane. Tenociti erano coltivati e utilizzati per esperimenti. Nel frattempo, la metà dei tessuti raccolti sono stata analizzata istologicamente ed è stato indicato che condividevano le stesse caratteristiche chiave della tendinopatia (displasia angiofibroblastic o iperplasia). Un’analisi secondaria di immunocitochimica ha confermato che le cellule coltivate erano tenociti con la maggior parte delle cellule che hanno le macchie positive per le proteine mohawk e tenomodulin. Le qualità della natura degenerativa di tenociti sono stati quindi determinate confrontando le cellule con il controllo sano mediante un’analisi di proliferazione o qRT-PCR. Il tenocyte degenerativa visualizzato un più alto tasso di proliferazione e simili modelli di espressione genica di tendinopathy corrispondenti rapporti precedenti. Nel complesso, questo nuovo protocollo potrebbe fornire uno strumento utile per gli studi futuri di tendinopatia.
Introduction
Tendinopatia è una condizione muscolo-scheletrica degenerativa cronica che si sviluppa in varie parti del corpo. Recentemente, il numero di casi di tendinopathy è aumentato notevolmente nel mondo sviluppato a causa della crescente partecipazione in attività sportive e una maggiore aspettativa di vita1,2. La causa della tendinopatia è considerata multifattoriale e queste cause comprendono ischemia, lesioni di radicali liberi dell’ossigeno, uno squilibrio tra innervazione vasocostrittore e vasodilatatore, micro-strappi interni ed i cambiamenti neuro-regolamento3 ,4,5,6,7,8. Maggior parte dei trattamenti per tendinopatia solo alleviare i suoi sintomi. Inoltre, trattamenti senza rigenerazione tissutale richiedono molto tempo per la riabilitazione ed ottenere una risposta limitata da tendini feriti, che impone una sfida clinica per i medici9.
L’incompetenza di opzioni correnti di trattamento insieme alla mancanza di capacità di tendine degenerante di Self-Heal ha piombo ricercatori ad interessarsi di esplorare strategie di trattamento alternativo. Recentemente, nuovi studi segnalati molti risultati promettenti per migliorare l’efficacia curativa dei tendini tendinopatie utilizzando fattori di crescita, basata sulle cellule staminali terapia e gene terapia10,11,12.
Attraverso una revisione della letteratura, abbiamo trovato che gli studi coinvolti possono essere diviso in due categorie basate sulla loro materiali di analisi: modelli animali come un topo, un topo o un coniglio; e modelli umani. Per quanto riguarda il modello animale, attualmente ci sono due tecniche popolari per generare tendinopathy: induzione chimica di lesioni o meccanico sovraccaricare il modello. Tuttavia, ogni modello animale è stato limitato nel riprodurre le tendinopatie umana complessa patologia13,14.
Maggior parte delle carte utilizzando campioni umani sono stati analizzati istologicamente o eseguita l’ in vitro esperimento basato su un tenocyte umano sano anziché un degenerativa tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. solo poche carte segnalato che hanno usato un umano tenocyte degenerativa, ma non ha descritto in dettaglio il protocollo utilizzato per ottenere il tenocyte degenerativa dal umano22,23. In questo contesto, si deve sottolineare che risultati di successo dal modello animale o il tessuto sano/tenocyte non possono necessariamente prevedere efficacia umana o dosaggio efficace perché la degenerazione del tendine è un processo complicato e la patogenesi è ancora non pienamente compreso.
Collettivamente, è necessario descrivere il protocollo standard per ottenere il tenocyte degenerativa dal tessuto umano senza causare effetti negativi al donatore. Questo articolo descrive un protocollo su come acquisire l’umana tenocyte degenerativa. Per convalidare il protocollo, i tessuti raccolti sono stati analizzati istologicamente. Quindi, le cellule in coltura è stata confermata come la tenocyte degenerativa mediante immunocitochimica (ICC), una reazione a catena della polimerasi di tempo reale quantitativa (qRT-PCR) e un’analisi di attuabilità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una serie di studi precedenti hanno riferito come creare modelli animali tendinopathic cronica, utilizzando diverse procedure quali collagenosi o kartogenin iniezione, tapis roulant in esecuzione e più26,27. Anche se numerosi studi hanno mostrato promettenti effetti terapeutici sulla base di questi modelli animali, esperimenti utilizzando il tenocyte degenerativa umana sarebbero stato fondamentali nel campo della tendinopatia al fine di riprodurre l’efficacia de…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Corea Health Technology R & D Project attraverso la Corea salute industria Development Institute (KHIDI), che è stato finanziato dal Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI16C1559).
Materials
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| Collagenase Ⅱ | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
Referencias
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