人間から退化的な Tenocyte を取得するためのプロトコル
Summary
In vitro変性線の使用は、障害への新しい治療の有効性を調査するときに不可欠です。ただし、ほとんどの研究は動物モデルのみまたは健全な tenocyte を使用します。手術中に人間の退化的な線を分離する次のプロトコルを提案します。
Abstract
寛解、腱の変性に対応して開発して痛みの状態は身体活動と寿命向上のための開発された世界の上昇にあります。その普及にもかかわらず根本的な病因はまだはっきりしていないし、治療は一般に徴候を示す。最近では、成長因子、幹細胞、遺伝子治療など多くの治療オプションを変性腱の治癒力を高めることを期待して調べた。ただし、これらの調査の大半は動物モデルまたは健康な人間の線だけで行った。にもかかわらず、いくつかの研究は、病理の線を使用して、我々 の知識の限りで無い現在人間の退化的な線の入手方法を記述するプロトコル。本研究の目的は、人間の退化的な線を取得するための標準プロトコルを説明します。当初は、腱組織は、手術中に外側上顆炎患者から収穫されました。その後、生検採取した伸尺橈側手根ブレビス腱手術時の構造変化に対応するから。鈍い、灰色、砕けやすい、すべて収穫した腱の登場し、浮腫状になった健康なものから視覚的に異なる。線は、培養され、実験用します。一方、収穫された組織の半分は組織学的に分析した、寛解 (angiofibroblastic 異形成または過形成) の同じ特徴を共有彼らことが示されました。免疫細胞化学による二次分析確認モホークと tenomodulin の蛋白質のための肯定的な汚れを持つ細胞の大半と線を培養細胞にしました。線の退化的な天性の資質は、拡散の試金または qRT PCR を使用して健康な制御と細胞を比較することによって定量しました。退行性の tenocyte には、高い増殖率と過去のレポートを一致する寛解の類似の遺伝子発現パターンが表示されます。全体的にみて、この新しいプロトコルは、寛解の将来の研究のための便利なツールあります。
Introduction
寛解は、体のさまざまな部分で成長する慢性退行性筋骨格の条件です。最近では、寛解の症例数は、レクリエーション スポーツ、高められた平均余命1,2への参加の増加開発の世界で大きく増加しました。寛解の原因は多因子になると考え、これらの原因は、虚血、酸素フリーラジカル傷害、神経-規制3 への変更、内部マイクロの涙は、血管収縮と血管拡張神経支配間の不均衡 ,4,5,6,7,8。寛解のほとんどの治療は、その症状だけを和らげます。また、組織再生せず治療はリハビリテーションに必要な長い時間、医師9の臨床的課題を課す負傷した腱からの限られた応答を達成するため。
変性腱の治癒能力が欠如している現在の治療法の選択肢の無能さには代替治療戦略を探るに関心の鉛の研究者。最近、新しい研究は成長因子を用いた寛解腱の治癒的効果を高めるため多くの有望な結果を報告、幹細胞ベースの治療と遺伝子療法10、11,12。
文献レビューを通じて関与する研究材料の解析に基づく 2 つのカテゴリ分けることができることがわかった: 動物はラット、マウス、ウサギ; などモデル人体モデル。に関して動物モデル、現在は寛解を生成する 2 つの人気のある技術: 傷害または機械的にオーバー ロード モデルの化学的誘導。ただし、各動物モデルは、複雑な人間の寛解病理13,14の再現に限られていた。
ひと試料を使用してほとんどの論文の組織学的検討を行ったまたは体外実験による変性 tenocyte15,16,17,18ではなく健全な人間 tenocyte,19,20,21. 論文が少ない報告彼らが人間退化的な tenocyte を使用が、彼らは詳しく書いてありません人間22,23から変性 tenocyte を取得するためのプロトコル。この文脈では、それに注意してください人間の有効性や効果的な投与のため複雑なプロセスであり、病因は腱の変性、動物モデルまたは健康な組織/tenocyte のいずれかの成功結果が必ずしも予測しません。まだ完全に理解しました。
総称して、ドナーへの副作用を引き起こすことがなく人間のティッシュから変性 tenocyte を取得するための標準プロトコルを記述するため必要です。この資料は、人間の退化的な tenocyte を取得する方法のプロトコルを説明します。プロトコルを検証するため、収穫された組織は組織学的に分析しました。その後、培養細胞は、免疫細胞化学 (ICC)、リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qRT PCR)、および実行可能性の試金を使用して変性 tenocyte として確認されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
先行研究の数は、コラゲナーゼや kartogenin 注入、トレッドミルを実行して、多くの26,27など異なるプロシージャを使用して慢性 tendinopathic 動物モデルを作成する方法を報告しています。数多くの研究は、これらの動物のモデルに基づいて有望な治療効果を示しが人間退化的な tenocyte を用いた実験重要になる寛解の分野で治療の効果を再現するため?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、技術研究開発プロジェクトを通じて、韓国保健産業開発研究所 (KHIDI)、韓国の福祉・厚生省によって資金を供給された韓国医療からの助成金によって支えられた (許可番号: HI16C1559)。
Materials
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| Collagenase Ⅱ | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
Referencias
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J. Models for the study of tendinopathy. Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes’ patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), 1359-1360 (2009).
