Modelleren van tuberculose in Mycobacterium marinum besmet volwassen zebravis
Summary
Hier presenteren we een protocol voor model menselijke tuberculose in een volwassen zebrafish met behulp van de natuurlijke ziekteverwekker Mycobacterium marinum. Geëxtraheerde DNA en RNA van de inwendige organen van besmette zebrafish kan worden gebruikt om te onthullen dat het totaal mycobacteriële ladingen in de vis en de immuunrespons van de gastheer met qPCR.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis is momenteel de dodelijkste menselijke pathogenen veroorzaakt 1,7 miljoen doden en 10,4 miljoen infecties per jaar. Blootstelling aan deze bacterie veroorzaakt een spectrum van brede ziekte bij mensen variërend van een gesteriliseerde infectie tot een actief vordert dodelijke ziekte. De meest voorkomende vorm is de latente tuberculose, die asymptomatisch, maar heeft het potentieel om te activeren in een fulminant ziekte. Volwassen zebravis en haar natuurlijke ziekteverwekker Mycobacterium marinum onlangs zijn gebleken een toepasselijke model te bestuderen van het spectrum van brede ziekte van tuberculose. Belangrijker, kunnen spontane latency, evenals reactivering en adaptieve immuunresponsen in het kader van mycobacteriële infecties bestudeerd worden in dit model. In dit artikel beschrijven we methoden voor de experimentele besmetting van volwassen zebravis, de collectie van interne organen voor de winning van nucleïnezuren voor de meting van mycobacteriële ladingen en host immuunrespons door kwantitatieve PCR. De in-huis ontwikkelde, M. marinum –specifieke qPCR assay gevoeliger is dan de traditionele plating-methoden zoals het detecteert ook DNA uit niet-delende, slapende of onlangs gestorven mycobacteriën. Zoals zowel DNA en RNA worden geëxtraheerd uit dezelfde persoon, is het mogelijk om te bestuderen van de relaties tussen de zieke toestand, en de gastheer en ziekteverwekker gen-expressie. De volwassen zebrafish model voor tuberculose dus profileert zich als een zeer toepasselijke, bij niet-zoogdieren in vivo systeem te bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) is een veel gebruikte diermodel in biomedisch onderzoek en het is een geaccepteerde model voor gemeenschappelijke gewervelde biologie. De zebravis is aangepast aan vele gebieden van onderzoek modellering van menselijke ziekten en stoornissen variërend van kanker1 en cardiale ziekte2 aan besmetting en immunologische studies van verschillende bacteriële 3 en virale infecties4 , 5. bovendien de ontwikkeling ex utero van zebravis embryo’s heeft gemaakt de zebravis een populair model in Ontwikkelingsbiologie6 en toxicologie7,–8.
Op vele terreinen van onderzoek, met inbegrip van infectie biologie, worden het optisch transparant zebrafish larven meestal gebruikt. De eerste immune cellen wordt binnen 24 uur bericht bevruchting (hpf), primitieve macrofagen zijn gedetecteerde9. Neutrofielen zijn de volgende immune cellen te verschijnen ongeveer 33 hpf10. Zebravis larven zijn dus haalbaar voor de studie van de vroege stadia van de infectie en de rol van aangeboren immuniteit in de afwezigheid van adaptieve immuuncellen11. De volwassen zebrafish met haar volledig functionele adaptieve immuunsysteem biedt echter een extra laag van complexiteit voor infectie experimenten. T-cellen kunnen worden gedetecteerd rond 3 dagen na bevruchting12, en B cellen zijn in staat om functionele antilichamen te produceren door 4 weken bericht bevruchting13. De volwassen zebrafish heeft alle de belangrijkste tegenposten van de zoogdieren aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De belangrijkste verschillen tussen de immune systems van vis en mensen worden aangetroffen in antilichaam isotypes zo goed zoals in de anatomie van lymfoïde weefsels. De zebravis heeft slechts drie antilichaam klassen14, terwijl mensen vijf15 hebben. In de afwezigheid van beenmerg en lymfeklieren, de primaire lymfoïde organen in de vis zijn de thymus16 , de nieren en de milt, de nieren en de darmen dienen als secundaire lymfoïde organen17. Ondanks deze verschillen met zijn volledige immuun arsenaal van aangeboren en adaptieve cellen, is de volwassen zebrafish een zeer toepasselijke, easy-to-use, bij niet-zoogdieren model voor gastheer-Ziekteverwekker Interactie studies.
De laatste tijd is de zebravis opgezet als een haalbaar model te bestuderen van tuberculose18,19,20,21,22. Tuberculose is een airborne ziekte veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis. Volgens de World Health Organization, tuberculose veroorzaakt1,7 miljoen sterfgevallen in 2016 en is de belangrijkste oorzaak van de dood door een enkele pathogen wereldwijd23. Muizen24,25, konijnen,26 es27 van de niet-menselijke primaten zijn dat de bekendste diermodellen met tuberculose onderzoek maar elk gezicht hun beperkingen. Het model van de niet-menselijke primaten van M. tuberculosis infectie lijkt de ziekte bij de mens meest nauw, maar met behulp van dit model is beperkt als gevolg van ernstige ethische overwegingen. Andere dierlijke modellen worden belemmerd door de gastheerspecificiteit van M. tuberculosis , dat is van invloed op de ziekte pathologie. Waarschijnlijk het grootste probleem in het modelleren van tuberculose is het brede spectrum van infectie en ziekte resultaten in de menselijke ziekten: tuberculose is een zeer heterogene ziekte variërend van steriliseren van immuniteit tegen infectie van het latente, actief en opnieuw geactiveerde28 , die moeilijk te reproduceren en experimenteel model kan zijn.
Mycobacterium marinum is een nauwe verwant van M. tuberculosis met ~ 3.000 orthologous eiwitten met 85% aminozuur identiteit29. M. marinum infecteert natuurlijk zebrafish granulomas, de kenmerken van tuberculose, in de interne organen19,30te produceren. In tegenstelling tot andere dierlijke modellen gebruikt bij tuberculose-onderzoek, zebravis produceert veel nakomelingen, het vereist slechts een beperkte ruimte en nog belangrijker is, het is neurophysiologically het minst ontwikkelde gewervelde tuberculose model beschikbaar. Bovendien, veroorzaakt de M. marinum infectie latente infectie, actieve ziekte of zelfs sterilisatie van mycobacteriële infecties in volwassen zebrafish nauw het nabootsen van het spectrum van ziekte resultaten van menselijke tuberculose19, 31 , 32. hier, we worden methoden beschreven voor het model van de experimentele tuberculose van volwassen zebrafish door M. marinum injecteren in de buikholte en kwantitatieve PCR te gebruiken voor het meten van de mycobacteriële ladingen en de immuunrespons van de zebravis weefselmonsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een qPCR gebaseerde toepassing voor het meten van mycobacteriële ladingen uit DNA geëxtraheerd uit experimenteel geïnfecteerde volwassen zebrafish weefsels. Deze toepassing is gebaseerd op inleidingen ontworpen rond de 16S-23S rRNA interne getranscribeerde spacer reeks40. De totale mycobacteriële vracht in een vis monster wordt geschat met behulp van een standaard curve bereid uit DNA geëxtraheerd uit een bekend aantal gekweekte mycobacteriën en uitgaande van dat die ene …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd door de Finse culturele stichting (H.L.), Tampere tuberculose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Stichting van de Finse vereniging van anti-tuberculose (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., ondersteund M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane and ihmissusi Erkko Foundation (M.P.) en Academy of Finland (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo en Jenna Ilomäki zijn erkend voor hun technische bijstand. De auteurs erkennen het Tampere Zebrafish laboratorium voor hun dienst.
Materials
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 ml homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
Referencias
- Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80 (2015).
- Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
- Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
- Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis–heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
- Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
- Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
- Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703 (2017).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
- Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
- Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
- Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
- Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
- Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
- Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
- Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
- Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
- Madigan, M., Martinko, J. . Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish:a practical approach. , (2002).
- Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091 (2014).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
- Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
- Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
- Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
- Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
- Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75 (2018).
- Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
- Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).
